Page 25 - 《水产学报》2025年第5期

郑卫卫，等 水产学报, 2025, 49(5): 059102

自山东省青岛市胶南市某养殖场。首先通过对 别扩增，筛选出能在雌性个体中扩增出 2 条
圆斑星鲽性腺进行石蜡包埋切片和苏木精-伊红 DNA 条带且在雄性个体中扩增出 1 条 DNA 条
(H.E) 染色来确定其表型性别，具体方法参照 带的引物对。PCR 扩增条件：95 °C 预变性 3
[8]
Chen 等 研究。根据性腺组织切片观察结果， min；95 °C 变性 30 s，30 个循环；55 °C 退火
选取 17 尾雌性和 17 尾雄性圆斑星鲽进行基因 30 s；72 °C 延长 7 min；72 °C 孵育 7 min。扩
组 DNA 提取，DNA 提取采用海洋动物基因组 增产物于 2% 琼脂糖凝胶电泳 30 min。然后利

DNA 提取试剂盒 [ 天根生化科技 (北京) 有限公 用成功扩增出目的条带的引物对对另外 10 尾雌
司 ]。然后用超微分光光度计 P100 (Pultton，美 性个体和 10 尾雄性个体按照相同的扩增条件进
国) 检测 DNA 的浓度，用 1% 琼脂糖凝胶电泳 行第 2 次 PCR 扩增验证。上述两次验证使用的
检 测 DNA 的 质 量 。 质 量 检 测 合 格 的 基 因 组 圆斑星鲽样品均来自山东省青岛市胶南市某养
®
DNA 用于构建 34 个片段大小为 300~500 bp 的 殖场。然后，用 Trelief DNA 凝胶提取试剂盒
基因组重测序文库，然后采用双端 150 bp 测序 (北京擎科生物科技股份有限公司) 分别回收纯
模式在 Illumina HiSeq 4 000 平台上进行测序。 化雌性个体和雄性个体的目的条带，并将纯化
基因组重测序的原始数据已上传到 NCBI 的 产物送北京擎科生物科技股份有限公司青岛分
Sequence Read Archive 公 共 数 据 库 (登 录 号 为 公司进行测序。最后，利用 DNAMAN 软件的
PRJNA877789)。本研究获得了中国水产科学研 多序列比对分析测序结果，确定雌性特异 DNA
究院黄海水产研究所实验动物管理和使用伦理 标记的序列。

委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守中
1.4 雌性特异 DNA 分子标记及遗传性别鉴定
国水产科学研究院黄海水产研究所实验动物管
方法的应用
理和使用伦理规范，并按照中国水产科学研究
利 用 本 研 究 获 得 的 圆 斑 星 鲽 雌 性 特 异
院黄海水产研究所动物实验伦理审查委员会制
定的规章制度执行。 DNA 分子标记和遗传性别快速鉴定方法，对乳

山市元泽水产养殖有限公司的 117 尾圆斑星鲽
1.2 雌性特异候选 DNA 分子标记筛选
进行遗传性别鉴定。同时对这 117 尾圆斑星鲽
使用 BWA 软件 (默认参数) [28] 将 17 尾雌性 的性腺进行组织石蜡包埋切片和 H.E 染色，以
个体和 17 尾雄性个体的重测序 reads 比对到圆 确定其性别是否与雌性特异 DNA 标记鉴定的性
斑星鲽基因组上 (GCA026259375.1)。然后，使 别一致。

用 SAMtools 软件 [29] 将比对后的 BAM 文件转换
2 结果
为排序的 BAM 文件，并进一步分析基因组每

个位置的测序深度和 reads 覆盖率。通过比对分
2.1 圆斑星鲽雌性特异候选 DNA 分子标记的
析，筛选出 Z 染色体和 W 染色体同源且 W 染
筛选
色体特异性插入的 DNA 片段 (插入型结构变异)。
通过基因组重测序，本研究共获得 17 尾
为了避免测序的假阳性和减少候选标记的数量，
雄性和 17 尾雌性圆斑星鲽的重测序原始数据，
本研究中选择至少被 5 条雌性个体 reads 覆盖而
分别为 325.36 和 328.99 Gb，基因组覆盖度约
不被任何雄性个体 reads 覆盖的 W 染色体上的
为 35×。此外，核苷酸统计结果显示，测序数
DNA 序列作为雌性特异候选 DNA 分子标记。

据的 Q20 和 Q30 平均值分别为 95.96% 和 90.40%
1.3 雌性特异 DNA 分子标记鉴定
(表 1)，说明测序质量较高，满足后续分析要求。
为了对上述雌性特异候选 DNA 分子标记 通过将 17 尾雄性和 17 尾雌性圆斑星鲽的重测
进行验证，利用 NCBI 的 Primer-BLAST 软件对 序 reads 与高质量圆斑星鲽基因组 (GCA0262
雌性特异 DNA 序列两翼约 150 bp 的序列 (Z 染 59375.1) 进行比对，获得了大量只被雌性个体
色体和 W 染色体同源) 设计雌性和雄性共享引 reads 覆盖而不被任何雄性个体 reads 覆盖的 Z
物对 (MF-F 和 MF-R)。然后用 4 尾雌性和 4 尾 染色体和 W 染色体同源且 W 染色体特异性插
雄性圆斑星鲽的基因组 DNA 对每个引物进行分 入的差异 DNA 片段。最终筛选出 359 条至少

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