Page 188 - 《水产学报》2023年第1期

孙东方，等 水产学报, 2023, 47(1): 019614

循环。使用长牡蛎 EfⅠα (LOC105338957) 作为内 技术重复，使用 2 −ΔΔC t 方法计算基因的相对表达
参基因。每个样品进行 3 个生物学重复和 2 个 水平。

表 1 本研究所用引物
Tab. 1 Primers used in this research
引物名称 序列 用途
names sequence (5′-3′) purpose
qHtatip2 F AACATTTTCTACATACCTCGTCC qPCR
qHtatip2 R CTGTCACACAATAAGATTCCTGG
BS-Htatip2 F TGTTGGAAAGGATTTTATAATTTTTG BS-PCR
BS-Htatip2 R TTATTTTTTACAATCCTATCCTAT
promoter_Htatip2 F GGGGTACCATGCTTACAGATATGATTTACATG bifluorescence
promoter_Htatip2 R CCCTCGAGACATTTCGAACGTTGTGGTG

1.5 Htatip2 在长牡蛎性腺不同发育时期的甲 使 用 Lipofectamine 3000 试 剂 盒 (Invitrogen)
基化分析 将 500 ng 的 pGL3-Htatip2 甲基化和未甲基化的质
粒分别转染到 500 μL 的人胚肾 293T (HEK 293T)
使用亚硫酸氢盐转化试剂盒 (天根生化科技
细胞中，同时转染 50 ng 的报告基因质粒 pRL-TK
有限公司) 将 1 μg 不同发育时期的性腺 DNA 转化
以监测转染效率并作为内部对照。所有的转染实
为 甲 基 化 PCR 模 板 。 2×Taq Plus Master Mix
验进行 3 次，每次 3 个技术重复。转染 24 h 后更
Ⅱ(Dye Plus) 酶 (Vazyme) 用于 PCR 扩增。使用甲
换培养基，48 h 后用 1×PBS 缓冲液清洗细胞，并
基引物扩增 Htatip2 上游−1 328~−1 019 bp 的片段，
在 100 μL 细胞裂解液中裂解。在 Synergy NEO2
每个时期设置 3 个生物学重复 (表 1)。扩增目标片
仪器中使用荧光素酶检测试剂盒 (Promega) 检测
段使用 20 μL 反应体系，包括 10 μL 混合液、0.8
裂解产物的荧光素酶活性，采用 Renilla 荧光素酶
μL 正反引物和 30 ng 模板。PCR程序设置为 95 °C， 的活性标准化检测结果。
3 min；95 °C，15 s，56 °C，20 s，72 °C，30 s，
1.7 数据分析
40 个循环；72 °C，5 min；4 °C 保存。通过切胶
回收目标片段，将回收产物与 pMD19-T (TaKaRa) 采用平均值±标准误 (SE) 表示 qRT-PCR 数据，
载体在 16 °C 下连接 5 h，然后转化至 DH5α 感受 方差分析两组数据间的差异。甲基化水平为发生
态细胞。随机选择 10 个单克隆进行 Sanger 测序。 甲基化的 C (胞嘧啶) 位点数量除以 C 位点总数。
利用 BiQ_Analyzer 软件进行亚硫酸氢盐的转化效 使用 Pearson 相关系数评估 DNA 甲基化和基因表
率和 DNA 甲基化水平计算以及数据可视化展示。 达之间的相关性，P<0.05 表示差异显著。

1.6 双荧光素酶报告验证甲基化对基因表达的 2 结果
调控作用

在 Htatip2 差异甲基化区段设计引物并在正 2.1 长牡蛎 Htatip2 同源性和进化树分析
向引物的 5′端添加 KpnⅠ酶切位点，在反向引物 使用 NCBI 保守结构域分析显示，Htatip2 包
的 5′端添加 XhoⅠ酶切位点 (表 1)。通过 PCR 技 含 CC3_like_SDR_a 结构域。对该结构域进行同源
术从基因组 DNA 中扩增该片段并纯化目的片段。 序列比对分析表明，长牡蛎 Htatip2 氨基酸保守结
目的片段和 pGL3.0 载体使用 KpnⅠ酶和 XhoⅠ酶 构域与美洲牡蛎 (C. virginica) 的 Htatip2-like 氨基
消化，然后用 T DNA 连接酶连接构建 pGL3.0- 酸保守结构域同源性最高 (88.73%)；与紫贻贝
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Htatip2 质粒。 (Mytilus edulis)、厚壳贻贝 (M. coruscus)、虾夷扇
利用 SssⅠ甲基化酶 (NEB) 甲基化 pGL3-Hta- 贝 (Mizuhopecten yessoensis)、地中海贻贝 (M. gal-
tip2 质粒的胞嘧啶。SssⅠ甲基化酶能够识别双链 loprovincialis) 的 同 源 性 较 高 ， 分 别 为 67.61%、
二核苷酸序列 (5'-CG-3') 中的胞嘧啶，并将胞嘧啶 67.14%、61.32% 和 56.25%；与节肢动物三疣梭子
残基甲基化。最后用 McrBC 酶 (NEB) 消化检验甲 蟹 (Portunus trituberculatus) 和凡纳滨对虾 (Litopen-
基化的质粒。甲基化的质粒被用于瞬时转染实验。 aeus vannamei) 的 Htatip2 同源性氨基酸保守结构

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