Page 187 - 《水产学报》2023年第1期
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孙东方，等                                                                 水产学报, 2023, 47(1): 019614

              源性的    miRNA  对长牡蛎能量分配和配子发生相关                     1    材料与方法
                                       [11]
              基因的调节导致三倍体不育 ；④DNA                  甲基化对
                                                                1.1    实验对象
                                                 [12]
              基因表达水平的调控与三倍体不育有关 。
                   长牡蛎三倍体的性成熟在个体间差异很大，                             本研究所用牡蛎采集于荣成市桑沟湾海区。
              除了遗传因素外，环境对其性腺发育的影响至关                            三倍体牡蛎由雌性二倍体和雄性四倍体牡蛎杂交
                   [2]
              重要 。表观遗传是环境和遗传之间的桥梁，在                            产生。2021   年  1—6  月，每月取      30  颗二倍体和三
              牡蛎环境适应性方面起着重要作用。迄今为止，                            倍体牡蛎的性腺组织用于性腺不同发育时期的基
              研究人员描述了四种表观遗传调控因子，即组蛋                            因表达和    DNA  甲基化模式分析。随机选择             6  颗成
              白修饰、DNA       甲基化、RNA      修饰和非编码       RNA      熟期二倍体长牡蛎，取其全组织               (鳃、外套膜、闭
                                                  [13]
              调控，其中      DNA  甲基化研究的最为深入 。DNA                  壳肌、消化腺、血淋巴唇瓣、雌性性腺和雄性性
              甲基化在     X  染色体失活、转录调控、基因印记的                     腺) 进行组织表达分析。所有性腺组织均取两份，
              维持及抑制转座子等方面具有重要作用。在长牡                            一份用波恩氏液固定，另一份用液氮冷冻后保存
              蛎中，DNA甲基化为镶嵌型分布，整体甲基化水                           在−80 °C  冰箱中。取鳃组织在流式细胞仪               (Βeck-
              平约为    2%，CG   位点甲基化水平为         12%~16% [14-15] 。  man Coulter, USA) 上检测倍性 。
                                                                                         [10]
              在之前的研究中，从不育型雌性三倍体                    3nβ  和可
                                                                1.2    生物信息学分析
              育型雌性三倍体         3nα  比较组中筛选了一些差异甲
                                                                   在  NCBI 数据库中使用        Blast 程序对   Htatip2
              基化区域      (DMR)，其中    Htatip2 (HIV-1 tat interac-
              tive protein 2，一种编码氧化还原酶的基因) 的启                  的氨基酸序列进行搜索。利用保守序列分别在
              动子区域在可育三倍体中的甲基化水平显著高于                            DNAMAN 9.0  和  MEGA 7.0  软件上进行同源性分
                                                               析和系统发育树构建。使用已发表的数据分析
                                     [12]
              不育三倍体的甲基化水平 。此外，Htatip2                 的表
                                                               Htatip2  在不同育性长牡蛎中的        DNA  甲基化模式，
              达水平在可育和不育三倍体间也存在差异，暗示
                                                               并用  IGV  浏览器展示 。
                                                                                 [12]
              DNA  甲基化可能通过调控基因表达水平影响三倍
              体性腺发育。                                            1.3    DNA  和  RNA  提取
                   Htatip2  是一种进化上保守的基因，在细胞凋
                                                                   根据组织学分析，将二倍体和三倍体雌性牡
              亡和肿瘤抑制中具有重要作用，特别是在控制参
                                                               蛎分为休止期、增殖期和成熟期，三倍体的成熟
              与细胞凋亡和肿瘤转移抑制基因的表达方面                       [16] 。
                                                               期又被分为可育型         (3nα) 和不育型   (3nβ)。用  DNA
              Htatip2  协同雌激素受体      α (Erα) 相互作用的共激活
                                                               提取试剂盒     (Tiangen) 从不同发育时期的性腺中提
              因子   CIA (coactivator independent of AF-2 function)
                                                               取基因组     DNA。用    TRIzol 试剂  (Invitrogen) 提取
              调节   Erα  介导的   c-Myc 转录  [17] 。此外，肝细胞中
                                                               RNA，取   30 mg  组织加   1 mL TRIzol，然后用氯仿
              Htatip2  的过表达或低表达影响了脂肪酸的存储和
                                                               抽提，异丙醇沉淀，75%          乙醇洗涤，最后用         DEPC
              氧化   [18] 。在敲除  Htatip2  的  Hela 细胞中，线粒体
                                                               水溶解。DNA       和  RNA  的浓度和完整性分别用
              呼吸维持在高水平，Hela 细胞显示出对低葡萄糖
                                                               Thermo nanodrop 2000  微量紫外分光光度计和         1%
              代谢的适应能力 。
                             [19]
                                                               的凝胶电泳检测。
                   本研究分析了长牡蛎          Htatip2 (LOC105325288)
                                                                1.4    Htatip2  在长牡蛎不同组织和性腺不同发
              蛋白保守结构域的同源性和系统演化，探讨了
                                                               育时期的表达分析
              Htatip2  基因在不同组织和三倍体性腺不同发育时
              期的表达模式，进一步分析了该基因启动子的                                 使 用 反 转 录 试 剂 盒     HiScript ⅡQ  Select  RT
                                                                                             ®
              DNA  甲基化水平在不同性腺发育时期的变化并与                         SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme) 将  1 μg
              表达水平关联，最后利用双荧光素酶报告实验验                            RNA  反转录为     cDNA。使用     ChamQ SYBR Color
              证了   DNA  甲基化对基因表达的调控作用。本研究                      qPCR Master Mix(Vazyme) 在  LightCycler 480 Ⅱ检
              旨在查清     Htatip2  在不同育性三倍体各发育时期                  测系统    (Roche) 上进行实时定量       PCR。定量     PCR
              的  DNA  甲基化谱及      DNA  甲基化的作用，研究结               的反应体系为       20 μL，包括   10 μL  混合液、0.4 μL
              果将为探究表观遗传对长牡蛎三倍体不育的调控                            引 物 和  10  ng  cDNA  (表  1)。 反 应 程 序 为  95  °C
              机理提供重要信息。                                        5 min；95 °C 15 s，56 °C 15 s，72 °C 30 s，40  个

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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