Page 128 - 《水产学报》2023年第1期

郑卫卫，等 水产学报, 2023, 47(1): 019109

Param 在 线 工 具 (https://web.expasy.org/protparam/) 脏、肌肉、脾脏、胸腺、大脑和幽门盲囊) 的转录
分析 SmMKK 蛋白的理化性质，包括氨基酸数目、 组数据 (对照组健康个体)，用于分析 SmMKKs 在
分子重量、理论等电点、不稳定指数等。 大菱鲆不同组织中的表达情况。
1.2 MKK 基因家族系统发育分析 1.7 生物应激转录组数据

使用 MEGA 11.0 [27] 中的 MUSCLE 方法对大 为了分析 SmMKKs 在生物应激 (免疫应答) 条
菱鲆、斑马鱼、青鳉和斑点雀鳝的 MKK 氨基酸 件下的表达模式，从 NCBI SRA 数据库中分别下
序列进行多重序列比对，然后利用邻接法 (NJ) 构 载了大菱鲆粘孢子虫 (Enteromyxum scophthalmi) 感
建进化树，进化树检验采用 Bootstrap 方法，检验 染的转录组数据集 SRP308109 [31] 和肿大细胞病毒
次数设置为 1 000，建树模型选择 Jones-Taylor- (Megalocytivirus) 感 染 的 转 录 组 数 据 集 SRP3473
Thornton(JTT) 氨基酸替代模型，其他参数设置为默 83 。SRP308109 数据集是对不同程度 (初期、轻
[20]
[28]
认。采用 EvolView 2.0 (https://www.evolgenius.info/ 度、中度和重度) 粘孢子虫感染和健康大菱鲆的血
evolview/) 对进化树进行可视化。 液进行转录组测序，健康、初期、轻度、中度和
1.3 染色体分布及重复基因分子进化分析 重度感染组分别有 8、14、15、13 和 10 个生物学
重复。SRP347383 数据集是对健康和感染肿大细
通过 GTF 文件获得染色体长度和基因位置信
胞病毒后第 3 天、第 6 天和第 9 天的头肾组织进
息，然后用 TBtool(v1.098769) [29] 绘制 SmMKKs 的
行转录组测序，每个组 3 个生物学重复。
染色体分布图。为了评估进化过程中大菱鲆 MKK
重复基因的选择压力，利用 TBtools 中的“simple 1.8 非生物应激转录组数据
Ka/Ks calculator functions”工具计算大菱鲆 MKK 为了分析 SmMKKs 在非生物应激条件下的表
重复基因对的非同义替换率 (Ka)、同义替换率 达模式，从 NCBI SRA 数据库中收集了 2 个热应
(Ks) 和 Ka/Ks 值。 激相关和 3 个盐度应激相关的转录组数据集。在

1.4 亚细胞定位及蛋白结构预测 SRA 实 验 SRP152627 [23] 中 ， 对 23 °C、 25 °C 和
28 °C 热应激处理 24 h 后及 14 °C 对照组的大菱鲆
用在线软件 WoLF PSORT (https://www.gens-
肾脏组织进行转录组测序。在 SRA 实验 SRP273
cript.com/wolf-psort.html) 对 SmMKK 蛋 白 进 行 亚
870 [32] 中，对 20 °C、24 °C 和 28 °C 热应激处理 24 h
细胞定位预测。用 SOPMA 在线软件 (http://npsa-
后及 14 °C 对照组的大菱鲆肝脏组织进行转录组
pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.
测序。在 SRA 实验 SRP238143 和 SRP153594 [25]
[33]
html) 预测 SmMKK 蛋白的二级结构。用 SignalP
6.0 在线软件 (https://services.healthtech.dtu.dk/serv- 中，分别对低盐 (5)、天然海水 (30) 和高盐 (50) 处
ice.php?SignalP) 对 SmMKK 蛋白进行信号肽预测。 理 24 h 后的大菱鲆鳃和肾脏组织进行转录组测序。
在 SRA 实验 SRP277001 [34] 中，对天然海水 (30) 和
1.5 基因结构和保守基序 (motif) 分析
淡水 (0) 处理 24 h 后的大菱鲆肝脏组织进行转录
从 GTF 文件中提取 SmMKKs 的基因结构注 组测序。上述所有转录组数据的对照组和处理组
释信息，通过在线软件 GSDS 2.0 (http://gsds.cbi. 均有 3 个生物学重复。
pku.edu.cn) 进行内含子-外显子分布模式分析。使
1.9 基因表达模式分析
用在线软件 MEME 5.4.1 [30] 对 SmMKK 蛋白序列进
首先用 STAR [35] 软件将上述转录组数据的
行 motif 分析，motif 数量设置为 12，其他参数为
reads 比对到大菱鲆基因组，然后利用 Subread [36]
默认值。另外，使用 DNAMAN 软件对 SmMKK
中的 featureCounts [37] 软件统计比对到基因组上的
蛋白序列进行多重序列比对。
reads 数并构建 reads 矩阵，接下来用 edgeR [38] 进
1.6 用于 SmMKKs 组织表达模式分析的转录
行差异表达基因分析 (P<0.05 为显著差异表达基
组数据
因，FDR < 0.05 且 |log2 FC| > 1 为极显著差异表达
从 NCBI SRA 数据库中下载大菱鲆 12 个不 基因)。利用 reads 矩阵计算 SmMKKs 在不同组织、
同组织 (精巢、卵巢、鳃、肝脏、肠道、血液、肾 生物应激和非生物应激条件下的表达量 (TPM)，

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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