Page 120 - 《中国医疗器械杂志》2025年第2期

Chinese Journal of Medical Instrumentation 2025 年 第49卷 第2期

监 管 与 测 试

当外引物（F3）与其互补区域结合并随后延伸时， 速，通常在10~20 min内即可完成 ，从而非常适
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DNA聚合酶启动DNA合成，导致链位移，释放出 用于快速分子诊断。然而，与其他技术相比，
单链DNA分子。此分子作为模板，使反向内引物 RPA技术的引物设计更为复杂，不当的引物设计可
（ backward internal primer, BIP）和外引物（B3）结合， 能会导致非特异性扩增或降低检测灵敏度。此外，
产生一个茎环DNA结构。在此步骤之后，LAMP进 RPA技术所使用的酶成本相对较高，这也是该技术
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入循环阶段，其中一个内引物与茎环杂交并启动位 相对于其他等温扩增技术的一个主要劣势 。
4）SDA。SDA利用限制性内切酶和嗜热脂
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移DNA合成，生成新茎环DNA 。该技术以其简便 （
的操作流程、更短的反应时间（通常不超过1 h）、 肪芽孢杆菌DNA聚合酶（bacillus stearothermophilus
高灵敏度和低成本等特点，已成为市场上最成熟的 DNA polymerase），在37 ℃恒定温度条件下扩增
等温核酸扩增技术之一。然而，该技术也存在一定 DNA序列，该技术要求在引物设计时包含限制性
的局限性。例如，由于其具有极高的扩增效率，偶 内切酶识别序列，并且在反应中添加限制性内切酶
尔可能导致假阳性结果的出现，且引物设计的复杂 和dUTP。当DNA聚合酶遇到dUTP时会停止延伸并
性相对较高。LAMP技术具有高灵敏度和反应时间 引发链置换反应，从而促使序列扩增。SDA用于细
短的特点，已被广泛应用于多种病原体的快速检 菌和病毒DNA的快速检测，如沙眼衣原体和淋病
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测，涵盖病毒（如 COVID-19 、寨卡病毒 、登 奈瑟球菌的检测 。SDA的一个主要缺点是不能扩
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革热病毒 ）、细菌（如结核分枝杆菌 、沙门氏 增较长的靶序列 。
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菌 ）和寄生虫（如疟疾寄生虫 ）等。 （ 5）HDA。HDA利用解旋酶和DNA聚合酶的
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（ 2）NASBA。NASBA的操作温度维持在41 ℃， 协同作用实现特定DNA靶序列的快速扩增。双链
主要用于扩增RNA。NASBA依赖禽类成髓细胞瘤 DNA被DNA解旋酶分离，然后被单链DNA结合蛋
病 毒 （ avian myeloblastosis virus, AMV） 逆 转 录 白包裹。两个序列特异性引物杂交到DNA模板。
酶、RNase H和T7 RNA聚合酶三种酶的协同作 DNA聚合酶将引物延伸到模板上以产生双链DNA，
用，以及两种特异性设计的引物和分子信标探针。 两个新合成的DNA产物随后被解旋酶用作底物，
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该 过 程 从 RNA逆 转 录 生 成 cDNA开 始 ， 随 后 由 进入下一轮反应 。HDA凭借其高灵敏度和特异
RNase H降解RNA模板链，T7 RNA聚合酶再合成 性，已被成功应用于多种病原体的快速诊断，如麻
新的RNA补偿链，从而实现目标RNA的指数级扩 疹病毒、副溶血性弧菌、沙门菌等病原体的快速诊
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增 。NASBA是一种专门为RNA扩增而设计的技 断 。然而，HDA检测的成本相对较高，可能会
术，能够以高特异性检测低水平的RNA，因此特 限制其在资源有限环境中的应用和普及。

别适用于RNA病毒的检测，如人类免疫缺陷病毒 2.3 等温扩增的关键控制因素
human immunodeficiency virus, HIV）、丙型肝炎
（ 在等温扩增的设计开发中，需要考虑多个关键
病 毒 （ hepatitis c virus, HCV） 等 [24-25] 。 然 而 ， 因素以确保反应的高效性和结果的准确性。
NASBA技术也存在一些局限，如需使用多种酶， （
1）精准的温度控制。尽管等温扩增避免了
导致反应条件较为复杂。此外，NASBA的最佳反 传统PCR的热循环步骤，但某些技术仍然需要在约
应温度相对较低，对温度变化较为敏感，温度波动 95 ℃的温度下打开双链DNA。其他等温扩增技术
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可能会影响实验结果的一致性和可靠性 。 则不需要这样的高温步骤，但它们需要在30~65 ℃
（ 的温度范围内保持恒定。因此，应确保扩增设备的
3）RPA。在37~42 ℃的最佳温度范围内，
RPA利用重组酶与DNA聚合酶的协同作用，识别 温度调控精度，以维持最佳反应条件。
2）引物设计与质量控制，等温扩增技术通
并插入模板链形成D环结构，并开始链置换反应。 （
被替换的模板链与单链结合蛋白结合，以维持单链 常采用长引物，这些引物容易形成二级结构（如二
的稳定性。之后，重组酶从复合体中分离出来， 聚体、发夹结构），从而干扰扩增过程。在设计引
DNA聚合酶与引物的3′端结合以延长链，形成新的 物时，需要通过专用软件预测这些二级结构，并尽
互补链。这一过程不仅高效，还对低浓度目标物 可能避免其形成。即便如此，在实际操作中，这些
高度敏感 。RPA技术已被广泛应用于病毒诊断、 结构仍然难以完全消除。为了减少非特异性扩增的
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细 菌 检 测 、 单 核 苷 酸 多 态 性 （ single nucleotide 风险，建议将扩增反应时间限制在30 min以内。然
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polymorphism, SNP）分析等多个领域 。相较于 而，此措施也增加了检测低拷贝数样本的难度 。
3）酶的性能优化。为提升扩增效率，应选
其他等温扩增技术，RPA最突出的特点是反应迅 （
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