Page 39 - 《渔业研究》2026年第2期

182 渔 业 研 究 第 48 卷

进化速率适中的基因，因其结构与功能研究已较为 已放回原养殖环境，未造成个体死亡。本研究方案
深入，常被用于分析亲缘关系较近的种间或属间群 已通过江西省水产科学研究所审批，批准编号为
[3]
体遗传多样性 。12S rRNA 属于一类不编码蛋白 JXFRI-EAE-20230710-01，所有实验操作均在审批
质的功能性核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）基 通过的方案框架内进行。
因，其序列中的大部分变异为中性突变，且进化速 1.2 方法
[4]
率较快，能够有效用于物种间同源性的比较 。位 1.2.1 DNA 提取
于线粒体 tRNA-Pro 和 tRNA-Phe 之间的 D-环区 取 30~50 mg 样品剪碎后置于提取板，加入裂
（Displacement loop region，D-Loop）是线粒体中 解液与蛋白酶 K 混匀，65℃ 过夜消化；提前在提
最长的非编码区，因该区域承受的选择压力最小、 取仪各工位备好磁珠、75% 乙醇及洗脱液；次日将
进化速率最快，其序列变异程度被视作检测种内 消化后的提取板裂解 15 min 后，再加入异丙醇，
[5]
遗传差异的理想指标 。鉴于不同线粒体基因片段 启动对应程序；程序结束后，取出洗脱板，检测
进化速率存在差异，本研究选择进化速率适中的 DNA 浓度和电泳胶，最后 4℃ 保存。
Cyt b、高度保守的 12S rRNA 及进化最快的 D-loop 1.2.2 DNA 浓度检测
片段联合分析，以全面揭示铜鱼养殖群体的遗传多 取 2 μL DNA 原液通过 NanoDrop 8000 进行检
样性特征。已有研究表明，养殖群体的遗传多样性 测。在核酸检测中，纯 DNA 的 A 260 /A 28 0 比值约
水平会在一定程度上受到养殖环境、繁殖方式及人 为 1.8，若该比值<1.8，表明可能含蛋白质、酚类
工选育等因素的影响 [6-8] 。亦有研究指出，不合理 杂质；若该比值>1.8，表明可能含 RNA 污染 [12] 。
的养殖管理措施和有限的亲本来源可能导致群体遗 纯 DNA 的 A 260 /A 23 0 比值一般处于 2.0~2.2 区间，
传多样性降低 [9-11] 。 若该比值偏低，则表明样本中可能存在碳水化合
目前，铜鱼已突破人工繁育技术，其规模化人 物、盐类等杂质 [12] 。
工养殖也逐步展开探索，但针对其养殖群体遗传多 1.2.3 DNA 完整性检测
样性的研究仍较为匮乏。开展遗传多样性研究，不 取 2 μL DNA 原液，加入 2 μL 溴酚蓝混匀后，
仅有助于选育优良性状的个体、优化养殖品种、提 进行电泳。电泳结果中，若条带清晰，则表明 DNA
升养殖效率与产量，还能增强养殖群体对环境变化 完整；若条带模糊且出现拖尾现象，则表明 DNA
及疾病的抵抗力。鉴于铜鱼选育与养殖过程中可能 可能发生降解 [12] 。
出现的种质退化问题，课题组在引进铜鱼养殖群体 1.2.4 聚合酶链式反应（Polymerase chain reac-
后，采用线粒体 DNA Cyt b、12S rRNA 和 D-loop tion，PCR）扩增及测序
序列分析技术，对人工养殖铜鱼群体展开遗传多样 研究中相关引物序列见表 1。
性分析，旨在揭示人工养殖铜鱼的遗传多样性及遗 PCR 扩增体系：总体系为 30.0 μL，包括约
传结构特征，为铜鱼种质资源相关研究提供理论 20 ng 基因组 DNA（1.0 μL，作为扩增的原始模
支撑。 板） 、上下游引物各 10 pmol（共 2.0 μL，用于引导

DNA 聚合酶启动扩增） 、2×Taq PCR Master Mix
1 材料与方法
15.0 μL、无菌双蒸水 10.0 μL。PCR 扩增程序：95 ℃
1.1 材料 预变性 5 min；随后进入 35 个循环，每个循环包
本研究所用的样本为 2023 年 4 月—7 月江西 括 95 ℃ 变性 30 s、退火 30 s（其中 Cyt b 序列退火
省水产科学研究所高新基地从中国水产科学研究院 温度为 58 ℃ [13] ，12S rRNA 与 D-loop 序列退火温
长江水产研究所引进的铜鱼养殖群体，随机选取健 度为 60 ℃） 、72 ℃ 延伸 5 min；循环结束后，72 ℃
康个体 30 尾，平均体质量为（48.90±42.22）g（范 终延伸 1 min。产物测序：目标扩增产物经试剂盒
围：27.11~117.23 g） ，平均体长为（13.71±5.02）cm 回收纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限
（范围：9.80~22.4 cm） 。每尾鱼剪取少许肌肉分 公司进行双向测序。
别放入 Eppendorf 管内，于 95% 乙醇中保存备用。 1.3 数据分析
实验所用铜鱼样本均来源于人工养殖群体，样 序列处理与比对：使用 ClustalX 1.81 软件对
本采集过程采用快速无伤的操作方式，避免对个体 DNA 序列进行编辑与比对，同时辅以人工校对，
造成额外的应激与伤害；实验处理后，健康个体均 以确保准确性 [14] 。