Page 28 - 《渔业研究》2026年第2期

第 2 期 喻大鹏等： 大眼双锯鱼 HSPA8 基因特征及其对运输胁迫的响应 171

Cloning Kit 均购自宝日医生物技术（北京）有限公 系 统 发 育 进 化 树 ； 利 用 Expasy 在 线 工 具 中 的
®
司；PerfectStart Green qPCR SuperMix 购自北京全 ProtParam 程序分析大眼双锯鱼 HSPA8 蛋白理化性
式金生物技术股份有限公司。 质 ， 利 用 ProtScale 程 序 分 析 蛋 白 特 性 ； 使 用
1.3 组织总核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA） SignalP 6 和 Deep-TMHMM 程序预测信号肽及跨膜
的提取和反转录 结构域；利用 SPOMA 和 Phyre2 程序预测分析蛋
使用 Trizol 法提取组织总 RNA，具体试验步骤 白质的二级结构、三级结构；亚细胞定位使用
严格参照 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent DeepLoc-2.1 程序；利用 SMART 程序分析蛋自功
试剂盒说明书进行。总 RNA 质量使用 1.0% 琼脂糖 能结构域和蛋白互作关系，各程序网址和分析参考
凝胶电泳进行判断，确保无基因组 DNA（Genomic 李旋等 [14] 和梁海燕等 [15] 的方法。
1.6 HSPA8 基因在大眼双锯鱼不同组织中的表
DNA，gDNA）残留。然后依照 HiScriptⅡ1st Strand
cDNA Synthesis Kit 说明书将质量合格的 RNA 反转录 达分析
成互补 DNA（Complementary deoxyribonucleic acid， 参 照 NCBI 数 据 库 中 HSPA8 基 因 （ 登 录 号
cDNA） ，−20 ℃ 保存备用。 NM 205003.2）序列，使用引物设计程序设计用于
实 时 荧 光 定 量 PCR（ Quantitative real-time PCR，
1.4 HSPA8 基因聚合酶链式反应（Polymerase
chain reaction，PCR）扩增与 CDS 区克隆 qPCR）的特异性引物，并送至生工生物工程（上
海）股份有限公司进行合成，引物信息见表 1。以
由于 NCBI 暂未收录大眼双锯鱼全基因组信息
2 周龄大眼双锯鱼不同组织总 RNA 反转录所得
及相关基因序列，本试验根据 NCBI 公布的同属
cDNA 为模板，以 18S 作为内参基因，依照 ChamQ
（鲈形目，雀鲷科、双锯鱼属）近缘物种眼斑双锯
Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书进
鱼（A. ocellaris）HSP70s 家族基因——HSPA8 基
行 qPCR 反应。qPCR 反应体系 10.0 μL：ChamQ
因开放阅读框（Open reading frame，ORF）信息，
Universal SYBR qPCR MasterMix 5.0 μL，上/下游
设计克隆引物，试验所需引物如表 1 所示。使用
引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL，RNase-free ddH O
PrimeSTAR Max DNA Polymerase 快速 PCR 聚合 2
®
3.0 μL。qPCR 反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，
酶，以大眼双锯鱼全肝脏组织 cDNA 为模板，对大
60 ℃ 30 s，35 个循环；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃
眼 双 锯 鱼 HSPA8 基 因 进 行 克 隆 。 克 隆 产 物 与
15 s。采用 2 −△△ct 法计算各基因的相对表达量。
pMD19-T 载体相连，转化大肠杆菌 DH5α 感受态
1.7 模拟运输试验
细胞，将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份
试验设置 5 组运输时间（0、6、12、24 和
有限公司测序。
48 h） ，分别记为 Ae-T0、Ae-T6、Ae-T12、Ae-T24、
表 1 试验所需引物 Ae-T48，同时设置不进行运输操作的对照组（Ae-CK），
Tab. 1 Primers required for the experiment 每个运输时间组分别打包运输。试验前先将大眼双
产物大小/ 锯鱼禁食 24 h。模拟运输试验使用聚乙烯袋作为运
基因 引物序列（5’—3’） bp 温度/℃
Genes Primer sequences (5’—3’) Product Temperature 输容器，每袋注入 4 L 人工海水，每袋放入大小相
size
似的大眼双锯鱼 5 尾，并把袋子内空气排空，充
F: ATGTCTAAGGGACCAGCAGTT 54.7
Ae- 入 4 L 纯氧。充氧完毕后，快速使用橡皮筋封口，
HSPA8 1 953
R: TTAGTCGACCTCCTCAATGGT 53.6 置于泡沫箱中，泡沫箱内有 4 个冰袋以便降低温
F: GCCTACGGAGCTGCTGTC 59.4 度，模拟运输试验期间禁止打开塑料袋。采用车载
q-Ae-
HSPA8 183 运输的方法，在中国水产科学研究院南海水产研究
R: GGTGGTGAAGGTCTGGGTTT 57.7
所深圳试验基地周边市政公路模拟运输，模拟真实
F: CGGTCGGCGTCCAACTTCTTAG 60.9
q-Ae- 144
actin 快递运输的操作、路况，运输安排如表 2 所示。在
R: TCTCGGCGAAGGGTAGACACAC 61.7
运输应激 0、6、12、24、48 h 时立即取样。

1.5 生物信息学分析 1.8 HSPA8 基因在不同运输时间下的表达变化
以克隆所得大眼双锯鱼 HSPA8 基因 CDS 区序 每个运输时间组在运输应激 0、6、12、24、
列为基础进行生物信息学分析。从 NCBI 上下载不 48 h 时立即取样，每组随机取 3 尾大眼双锯鱼，分
同 物 种 HSPA8 的 核 苷 酸 序 列 并 使 用 DNAStar 别取出鳃、肝脏、肾脏、脾脏、皮肤和肠道 6 个组

7.0 软件中的 MegAlign 模块进行相似性分析并构建 织，装入提前标记好的冻存管内，置于液氮中速