Page 77 - 《渔业研究》2026年第1期

74 渔 业 研 究 第 48 卷

系 [11] （25.0 μL） ：上、下游引物（27F：5’-AGAGT 培养 24~28 h，具体操作及判定参考美国临床实验
TTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492R：5’-TACGGCTAC 室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards In-
CTTGTTACGACTT-3’）各 1.0 μL，DNA 模板 1.0 μL， stitute，CLSI）的执行标准。
预混液 12.5 μL，双蒸水 9.5 μL；扩增程序：94 ℃ 1.8 全基因组测序分析
预变性 5 min；94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 使用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组，由生

延伸 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 终延伸 10 min。DNA 工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因组测
扩增产物通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生 序分析。用牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Tech-
工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序 nologies，ONT）三代测序数据组装基因组，对组
所得序列与 NCBI 下载的细菌序列进行比对，基于 装结果进行二代 Illumina 校正 [13] ；将校正后的菌株
邻接法（Neighbour joining，NJ）采用软件 MEAG 组装结果进行基因组分析和功能注释 [14] ，并将氨
7.0 构建细菌系统发育树。 基酸序列与毒力因子数据库（Virulence factor data-
1.6 药物敏感性试验 base，VFDB）进行比对，分析毒力基因结果。
采用琼脂平板纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B） 1.9 菌株毒力基因验证
对病原菌 HD4 进行药物敏感性分析。将菌落置于 从测序结果中选取 8 种毒力基因，包括 SRH
8
灭菌生理盐水中，通过麦氏比浊法制成 1×10 CFU/mL 裂解酶基因 luxS、脂蛋白基因 llpA、趋化性蛋白基
（0.5 MCF）的菌悬液浓度，将菌悬液均匀地涂布 因 cheW 和 cheY、GDP-甘露糖-6-磷酸异构酶基因
在胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptone soya agar，TSA） gmhA/lpcA、脂多糖相关酶基因 kdsA、鞭毛蛋白基
平板上，用灭菌镊子将不同类型的 15 种抗生素 因 fliM、酪氨酸激酶基因 tapT，根据不同的毒力基
（青霉素 G、红霉素、大观霉素、氯霉素、克拉霉素、 因序列设计特异性引物（表 1） ，验证全基因组毒
氨苄西林、万古霉素、克林霉素、四环素、米诺环 力基因测序结果。

素、诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星、多黏霉素 B、 表 1 毒力基因引物序列
呋喃妥因）药敏纸片贴在 TSA 平板上，倒置平板 Tab. 1 The primers of virulence gene sequences
于 28 ℃ 恒温培养箱培养 24 h，然后测定抑菌圈直 引物 Primers 序列 Sequences
径，以判断菌株药物敏感性 [12] 。 luxS-F 5’-ATGCCACTACTGGATAGCTTCAC-3’
1.7 水产养殖用药抑菌试验 luxS-R 5’-ATCGACTTTCAATTCTTGAAGCATT-3’
采用微量法测定病原菌 HD4 对 8 种农业农村 IlpA-F 5’-ATGAAATTCAACGTTAAGAATTTACTC-3’
部《水产养殖用药明白纸 2025 年 1、2 号》允许使 IlpA-R 5’-TTACCAGCCTTTAACAACACCACCT-3’
用的水产用抗菌药物（恩诺沙星、硫酸新霉素、甲 cheW-F 5’-ATGTCTCAAACGATGGATGTTGAAC-3’
砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺 cheW-R 5’-TTATAGATAAGCCATTTCATCCCAC-3’
间甲嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶）的最小抑菌 cheY-F 5’-ATGAAAATCCTTATTGTTGACGACT-3’
浓度（Minimal inhibit concentration，MIC） ，挑取 cheY-R 5’-TTATAAACGCTCGAAAATTTTGTCT-3’

纯化后的单个菌落于生理盐水中，配制成 0.5 MCF gmhA/lpcA-F 5’-ATGTACCAAGATCTAATTAGAAACGAG-3’
的菌液（A 管） ，随后取 2 支 10 mL 无菌生理盐 gmhA/lpcA-R 5’-TTATTCCATCTCTTTTTCAATCAAT-3’
水，打开任意 1 支，以无菌的方式向阴性对照孔中 kdsA-F 5’-ATGGAAATGAAAACGGTACACGTAG-3’
分别加入 200 μL 无菌生理盐水；又从 A 管中吸取 kdsA-R 5’-TTATTTAATGTCAATGTGCTCAAAAC-3’
200 μL 悬液加入到打开的 10 mL 无菌生理水中，制 fliM-F 5’-ATGGATATGCAAAAAACAGAGATG-3’
成 B 管。B 管中所有的菌液倒入到经灭菌的 V 形 fliM-R 5’-TCATCGGTTGGTTTCCTTATCATTA-3’
tapT-F 5’-ATGGATATCACCGAGTTACTAGACTT-3’
槽内，再将另 1 支 10 mL 无菌生理盐水倒入 V 形
tapT-R 5’-CTATTGAAACATTGAACCGTGCTG-3’
槽中。混匀后，利用微量移液器吸取 V 形槽中的
菌液加入到所有微孔中，每孔 200 μL；将加好样
2 结果与分析
的药物敏感性分析试剂板放入到 28 ℃ 培养 24~
8
28 h 后，读取结果。重新配制浓度为 2×10 CFU/mL 2.1 病原菌的分离及形态观察
病原菌 HD4 菌悬液备用，吸取 100 μL 菌悬液加入 健康紫海胆状态好、体表棘刺完整（图 1a） ；
96 孔药物敏感性测试版，将测试板置于 28 ℃ 恒温 患病紫海胆则表现出摄食量明显减少、吸附桶壁能