Page 44 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 闫 慧等： 稀有鮈鲫 GCRV 共居感染模型的建立与评估 585

间每日观察并记录发病情况。 进行组别设置，即通过腹腔注射接种复壮病毒液
采集出现典型出血症状的濒死鱼，去除体表组 （15 μL/尾，4.25×10 拷贝/μL）的感染组（n=50）
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织后称重，按 1∶1（W/V）比例加入预冷的磷酸 和注射等体积 PBS 的对照组（n=50） ，并进行下
盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS） ，制备 尾鳍剪切处理。随后，为模拟自然传播感染途径，
病毒组织母液，于−80 ℃ 保存。使用前，将母液按 另取 100 尾健康稀有鮈鲫，随机分为 2 组，进行
上述相同步骤离心、过滤，测定病毒拷贝数为 8.5× 上尾鳍剪切处理，分别与上述注射组共同饲养于 10 L
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10 拷贝/μL，将病毒液稀释至 4.25×10 拷贝/μL， 水体中，从而在严格控制条件下实现病毒由注射感
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−80 ℃ 保存备用。 染鱼向水体中健康接触鱼的自然传播。在攻毒期
1.4 感染实验设计 间，持续充气，水温维持在（28.0±0.5）℃，每日
本实验采用共居感染方式以探究 GCRV-Ⅱ在 定时观察并记录实验鱼的摄食、游动及临床症状等
稀有鮈鲫中的水平传播率，具体设计如下：首先 状态变化。实验设计流程图如图 1 所示。

健康稀有 鲫 注射组 共居感染组

Healthy G. rarus Infection group Co-habitation infection group

剪上尾鳍
Clipping of the ventral lobe
of the caudal fin

剪下尾鳍
Clipping of the dorsal lobe
of the caudal fin
注射 GCRV-YX246
Inoculation with GCRV-YX246
图 1 稀有鮈鲫共居感染流程设计图
Fig. 1 Schematic diagram of the experimental design for co-inhabitation infection of G. rarus

1.5 样品采集与 RNA 提取 保存备用。
分别对注射组与共居感染组中处于发病濒死状 1.6 病毒载量及免疫相关基因表达量测定
态的稀有鮈鲫实施麻醉并处死，随机选取 15 尾， 采用 qRT-PCR 技术检测稀有鮈鲫鳃、脾脏
分别采集其鳃、脾脏及后肠组织。将每 3 尾鱼的同 及后肠组织中病毒衣壳蛋白基因（Vp5）载量及宿
一组织置于同一样品管中进行 RNA 提取（视为一 主抗病毒免疫基因（Mx1）的相对表达水平。反应
个生物样本，n=1） ，加入 1 mL TRIzol 试剂，并 体系为 10.0 μL：包含 5.0 μL 2×SYBR Green Master
用组织研磨仪充分匀浆。随后进行总 RNA 提取， Mix、0.4 μL 引物（10 μmol/L，正、反向引物各
经检测浓度与纯度后，使用 Hifair Advance Fast 0.2 μL） 、4.6 μL cDNA 模板和 5.0 μL 定量酶混合
®
One-step RT-gDNA Digestion SuperMix 试剂盒，依 液。反应程序设置如下：95 °C 预变性 30 s；随后
照说明书进行基因组脱氧核糖核酸（Deoxyribonu- 进行 40 个循环的扩增反应，包括 95 ℃ 变性 10 s
cleic acid，DNA）去除及第一链互补 DNA（Comple- 和 60 °C 退火/延伸 30 s。本实验所用引物序列详见
mentary DNA，cDNA）合成，所得 cDNA 于−80 ℃ 表 1。

表 1 qRT-PCR 引物序列
Tab. 1 qRT-PCR primers
名称 序列（5’—3’ ） 登录号
Name Sequences (5’—3’ ) Accession numbers
F: AATTACAGGCCTCAAGAGGGG
Ef1α CM040919.1（5 396 839－5 399 315）
R: GCAGGTTGTCCACACCTTCT
F: GCTGATGCTGCAGACGGCTAAAC
Vp5 GQ896337
R: TAATTGCCTGCTGCGCTGACT
Mx1 F: AATTACAGGCCTCAAGAGGGGR: GCAGGTTGTCCACACCTTCT CM040914.1（8 965 397－8 969 733）