Page 131 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 吴叶凡，等：海洋细菌胞外多糖可拉酸提取及其对厚壳贻贝稚贝附着的作用 50 卷

表 1 四因素三水平响应面法设计 试。采用 Thermo ICS5000 离子色谱系统 (ICS5000，
Tab. 1 Displays the variables and their Thermo Fisher Scientific，美国)，通过电化学检测器
respective levels for the four-factor, three-level response 检测单糖组分。采用 Dionex CarboPac PA20
TM
TM
surface methodology design (150 mm×3.0 mm，10 μm) 液相色谱柱；最大进样量
因素 水平 level 为 5 μL。流动相 A 为 H O，流动相 B 为 0.1 mol/L
2
factor −1 0 1
NaOH，流动相 C 为 0.1 mol/L NaOH 和 0.2 mol/L
pH (A) 5.5 6.0 6.5
NaAc，流速为 0.5 mL/min；柱温保持为 30 ℃；
温度(B)/℃ temperature 25 30 35 洗脱梯度为：0 min A 相/ B 相/ C 相 (95∶5∶0，
时间(C)/h time 12 18 24 体积比)，26 min A 相/ B 相/ C 相 (85∶5∶10，体
接种量(D)/% inoculum quantity 7 8 9
积比)，42 min A 相/ B 相/ C 相 (85∶5∶10，体积
收 集 1 mL 菌 液 至 1 个 1.5 mL 无 酶 Tube 管 中 比)，42.1 min A 相/ B 相/ C 相 (60∶0∶40，体积
(n=3)。100 ℃ 条件下加热 10 min 后，4 000 r/min 离心 比)，52 min A 相/ B 相/ C 相 (60∶40∶0，体积比)，
15 min，离心后收集上清液，弃去沉淀。取 1 mL 52.1 min A 相 / B 相 / C 相 (95∶5∶0， 体 积 比 )，
含有可拉酸的上清液，与 4.5 mL H SO /H O (6∶1， 60 min A 相/ B 相/ C 相 (95∶5∶0，体积比)。
2
4
2
体积比) 溶液混合，煮沸 20 min。待反应液冷却至 1.4 可拉酸诱导厚壳贻贝稚贝附着
室温后，取 200 μL 于 396 nm (A396 ) 与 427 nm 可拉酸溶入 1% 琼脂糖凝胶溶液，选择浓度梯
co
(A427 ) 波长下测定吸光度；剩余样品溶液加入
co
100 μL 3% (质量分数) 半胱氨酸盐酸盐溶液，25 ℃ 度为 10、20、50、100、200、500 mg/L。将 1 mL
可拉酸与琼脂糖混合液均匀滴加到灭菌载玻片上，
避光静置 1 h，396 nm (A396 ) 和 427 nm (A427 )
cy
cy
直至完全覆盖，无菌环境下凝固。在 20 mL 灭菌
处测吸光值。以 L-岩藻糖 (标准品，Sigama) 作为
过滤海水体系中，共同放置凝固后的载玻片与 10
浓度标准曲线。计算菌液中可拉酸含量的公式：
只稚贝，观察其附着情况。实验条件为 18 ℃、黑
y= 764.2×[(A396 cy −A396 co )−(A427 cy −
暗状态。设定普通载玻片为空白组对照，以琼脂
A427 co )]−6.795 (1)
糖凝胶固体作为另一对照，记录 48 h 的附着率。
式中，计算所得的可拉酸含量单位为 μg/mL。
1.5 可拉酸处理厚壳贻贝足丝蛋白的基因定量
可拉酸的提纯工艺流程 将海假交替单
胞菌 Δ01912 菌株于 2216E 培养基中活化培养 16~ 设置不同浓度的可拉酸浓度，选取生物被膜
18 h，培养后的菌株转移至 M9 培养基中培养 1~ 上诱导活性最好的 20 及 50 μg/mL 浓度，将贻贝
3 d。培养后的菌株用沸水加热 5 min，冷却至室 成贝用开贝器撑开小口，将稀释后的可拉酸注射
温后 4 000 r/min 离心 30 min，保留上清液，冻干。 至闭壳肌中。将处理后的贻贝放入盛有 10 L 充气
取冻干后的可拉酸粗提物，按每 5 mg 溶于 1 mL 天然海水中，每个处理组有 4 盆分别盛有 6 只随
ddH O 2 的质量比溶解，于 4 ℃ 条件下 15 000 r/min 机挑选的可拉酸处理过的厚壳贻贝。在 3、6、12、
离心 20 min，取上清液，加入 1% 冰醋酸，煮沸加 24、48 和 72 h 时剪下贻贝整个足组织，用灭菌剪
热 2 h，冷却至室温后，于 4 ℃ 条件下 15 000 r/min 从其基部剪下后放入无酶 Tube 管中，随后将无酶
离心 30 min，保留上清液，将样品与等体积的氯 管放入液氮中速冻，–80 ℃ 保存。
仿-甲醇混合液 (2∶1，体积比) 充分混合，混合后 足组织化冻后，向各管中加入 1 mL DEPC 水

静置 24 h 待分层，移液枪尽可能取出水相，10 K 溶液洗涤组织 2 次。清洗完全后，用灭菌剪剪碎
道尔顿的透析袋透析 48 h。透析袋内样品冻干， 足组织，加入 200 μL RNAiso plus，用电动研磨器
于紫外光下照射 2 h，密封保存。 研磨剪碎的足组织小块。按照 RNAiso Plus 试剂
离子色谱法测定可拉酸单糖组成 取干净 手册进行操作，提取不同可拉酸处理后的足组织
的色谱瓶，称取适量多糖样品，溶于 1 mL 2 mol/L RNA， 通 过 Nanodrop 2000 核 酸 定 量 仪 (Thermo
TFA 酸溶液中，121 ℃ 加热 2 h。通氮气吹干，加 Fisher Scientific，美国) 测定浓度，再通过琼脂糖
入 99.99% 甲醇清洗并再次吹干，重复清洗 2~3 次。 凝胶电泳来确定不同处理组足组织 RNA 完整性。
将样品溶解于无菌水中，转移至色谱瓶中进行测 将收集样品的 RNA 反转为 cDNA 用于荧光定量。

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