Page 70 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 李治平，等：缢蛏 HIF-1 和 PHD2 基因鉴定及其在低氧胁迫下的表达 50 卷

48 h，每组随机取 3 只缢蛏并采集鳃组织。取 0 h rRNA (表 1)。RT-qPCR 反应体系 (20.0 μL)：2 × SYBR
缢蛏的鳃、肝胰腺、闭壳肌、水管、外套膜和足 Green Mix [1184ES08，翌圣生物科技 (上海) 有限
6 个组织，液氮速冻处理后置于−80℃ 冰箱保存。 公司 ] 10.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模
板 0.8 μL，ddH O 8.2 μL。反应程序：95 °C 预变
1.4 RNA 提取和 cDNA 合成 2
性 10 s，95 °C 变性10 s，60 °C 延伸 30 s，40 个循
使 用 RNA-easy Isolation Reagent (R701-02， ®
环。反应在 Light Cycler 480Ⅱ (Roche，美国) 实
南京诺唯赞生物科技股份有限公司) 提取缢蛏各组 时荧光定量 PCR 仪上进行。使用 2 −∆∆C t 法计算基
织的总 RNA，并利用 1% 琼脂糖凝胶电泳和 Nano- 因在组织中的相对表达量，每个样品 3 个技术重
Drop 2000 (ThermoScientific， 美 国 ) 检 测 样 品 总 复，取平均值。使用 SPSS 25.0 软件对数据进行显
RNA 浓度和质量。根据 1 Strand cDNA Synthesis 著性分析，P<0.05 表示差异具有统计学意义。柱
st
SuperMix [11141ES60，翌圣生物科技 (上海) 股份
状图通过 Origin Pro 2022 软件绘制完成。
有限公司 ] 的使用说明，将各组织总 RNA 反转录

为 cDNA，用于 HIF-1 和 PHD2 的克隆和表达分析。 表 1 实验所用的引物序列
Tab. 1 Primer sequences used in this study
1.5 缢蛏 HIF-1 和 PHD2 基因克隆和序列分析
引物 primers 序列(5′-3′) sequence(5ʹ-3ʹ) 用途 usage
利用 GenBank 中长牡蛎 HIF-1α (BAG85183.1)、
ScHIF-1α-F1 CAGCAATACAAGTGTGCATGG ORF扩增
HIF-1β (AMZ80123.1)、 PHD2A (AVE14374.1) 和 ScHIF-1α-R1 GGACGTTTTAAGTGGAGAGCC
PHD2B(AVE14375.1) 蛋白序列与缢蛏基因组和转 ScHIF-1β-F1 TGTGTACCCAAGAGACAACC
录组数据进行本地 tblastn 比对，获得缢蛏 HIF-1 ScHIF-1β-R1 TCTCCAACTTCTCTCTTCTTGCT
和 PHD2 基因的预测序列。使用 NCBI 在线引物 ScPHD2A-F1 TTTCGGACACAAGTTGCGGA
设 计 工 具 Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih. ScPHD2A-R1 GCTATGCCAATGTGTGCAGG
gov/Blast.cgi) 设计缢蛏 HIF-1α、HIF-1β、PHD2A ScPHD2B-F1 CGTAATTTTCACACGCCGTCA
和 PHD2B ORF 区域特异性引物克隆全长序列 ScPHD2B-R1 TCCGCTCTAAAGCCTTGACAT
(表 1)。PCR 扩增得到的产物使用 DNA 纯化试剂
ScHIF-1α-F2 GATGGCCCAGTCCAACAAGA 实时荧光定量PCR
盒 (DC301-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公 ScHIF-1α-R2 TCTCGCGTGTTAATGGTGCT RT-qPCR
司) 纯化，纯化产物连接到 pMD19-T 载体 (6013， ScHIF-1β-F2 CTCTATCGTGCCCGTCCTTC
TaKaRa，日本) 后转化感受态 DH5α (C502，南京 ScHIF-1β-R2 ATGCCCCTCTTTCTTGACGG
诺唯赞生物科技股份有限公司)，提取质粒，并通 ScPHD2A-F2 GCTGGGTGGTAGCTCAGAAG
过 Sanger 法测序验证。 ScPHD2A-R2 CGTGCCTCTACCACACTGAG
利 用 Expasy 在 线 工 具 (https://swissmodel.ex ScPHD2B-F2 GAGTTCTGCGAGTGTTGCCT
pasy.org/) 推导基因编码的氨基酸序列，并分析蛋 ScPHD2B-R2 CTGGTTGCACTTCATGGGGA
白 的 理 化 性 质 ； 利 用 SMART 在 线 工 具 (http:// Sc18SrRNA-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT
smart.embl-heidelberg.de/) 和与人氨基酸序列比对 Sc18SrRNA-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA
预测蛋白质结构域的结构和位置；利用 Clustal X
软件进行氨基酸多序列比对；利用 MEGA X 软件 2 结果
采用邻接法 (Neighbor-Joining，NJ) 构建系统进化
树，Bootstrap 值为 1 000 次。 2.1 缢蛏 HIF-1 和 PHD2 序列分析

1.6 缢蛏 HIF-1 和 PHD2 基因的表达分析 通过分子克隆鉴定，获得了缢蛏 HIF-1α、
根据已发表缢蛏不同发育时期转录组数据 ， HIF-1β、PHD2A 和 PHD2B 的完整 ORF 序列。4
[28]
分析缢蛏 HIF-1 和 PHD2 基因在 8 个发育时期 (卵 个基因序列信息已上传至 NCBI，GenBank 登录号
子、4 细胞、囊胚、原肠胚、担轮幼虫、D 形幼 为 OQ658614~OQ658617。
虫、壳顶幼虫和稚贝) 的表达情况。根据 ScHIF- ScHIF-1α ORF 为 2 202 bp，编码 733 个氨基
1α、 ScHIF-1β、 ScPHD2A 和 ScPHD2B的 ORF 序 酸 (图 1)，预测蛋白分子量为 82.4 ku，理论等电
列设计 RT-qPCR 特异性引物，内参基因为 Sc18S 点为 5.4，不具有信号肽和跨膜区。ScHIF-1β ORF

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