Page 189 - 《水产学报》2026年第2期
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2 期            熊舒婷，等：草鱼和赤眼鳟          ifi27l2a  基因分子特性、原核表达及抗病毒功能比较                       50 卷

              后分别取其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、头肾、鳃、                           涂布在含相应抗生素的平板中，倒置培养14 h。挑
              皮肤、肌肉等组织，液氮速冻后置于−80 ℃。另                          取单菌落，经       PCR  鉴定后送至北京擎科生物科技
              取攻毒前后的赤眼鳟、草鱼肝脏、脾脏、肾脏等                            股份有限公司测序。将测序正确的重组质粒扩大
              组织，液氮速冻后置于−80 ℃，待后续                RNA  提取。      培养，根据去内毒素质粒提取试剂盒                   (OMEGA，
                                                               美国) 说明书提取质粒。引物序列见表                1。
               1.3    总  RNA  提取、cDNA  合成及定量      PCR
                                                                1.5    生物信息学分析
                   取上述速冻处理的赤眼鳟、草鱼少许组织样
              及攻毒前后的组织样品，根据                RNA  提取试剂盒              采 用   DNAMAN    软 件 对 赤 眼 鳟      ifi27l2a
              (北京全式金生物技术股份有限公司) 说明书提取                          (Scifi27l2a)、 草 鱼  ifi27l2a  (Ciifi27l2a) 的  CDS  序
              RNA， 使 用 超 微 量 分 光 光 度 计 检 测 其 浓 度 及             列及其编码的氨基酸序列进行分析。通过                   ExPASy
              OD  值，1%   琼脂糖凝胶检测其质量及完整性。取                      ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋
              质量较好的      RNA  根据逆转录试剂盒         (赛默飞世尔          白质理化性质，通过           NCBI 数据库 (https://www.
              科技公司) 说明书进行           cDNA  的第一条链合成。             ncbi.nlm.nih.gov/) 检索获取不同物种的        IFI27L2A
              以  β-actin  作为内参基因，赤眼鳟、草鱼各组织样                    同源序列。采用        MEGA11  软件的邻接法构建系统
              的  cDNA  作为模板，使用荧光定量              PCR  试剂盒       发育进化树，并通过           Chiplot (https://www.chiplot.
              ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (南京诺        online/circleTree.html) 网站美化。使用    DNAMAN
              唯赞生物科技股份有限公司) 进行荧光定量                     PCR     软件进行多序列比对，利用             SMART (http:// smart.
              (qPCR) 检测，反应体系为          10 μL：2×ChamQ Uni-      embl-heidelberg.de/) 在线网站分析蛋白质结构域，
              versal SYBR qPCR Master Mix，5 μL，ddH O，3 μL，     使用  SWISS-MODEL   网站 (https://swissmodel.expasy.
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              上下游引物各        0.5 μL，cDNA, 1 μL。内参及待检            org/interactive) 预测草鱼和赤眼鳟      IFI27L2A  的蛋
              测基因每组设置        3  个重复，反应程序为        95 ℃ 30 s，    白三级结构。使用        ProtScale (https://web.expasy.org/
              95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，39  个循环，熔解曲线程序：                protscale/) 网站在线预测   CiIFI27L2A  和  ScIFI27L2A
              65~95 ℃  每  5  秒增加  0.5 ℃。                       的蛋白亲疏水性。

               1.4    载体构建                                      1.6    抗病毒实验相关操作
                   以赤眼鳟或草鱼         cDNA  为模板，采用       Gen-         转染前一晚将长势密集的赤眼鳟肾细胞系
              Star 超保真   PCR  预混试剂    (北京康润诚业生物科               (SCK) 经胰酶消化后接种于          12  孔板中。至第     2  天
              技有限公司) 进行        PCR  扩增，反应体系为         50 μL：    细胞融合度达到        70%~80%  时，使用      PEI 转染试
              cDNA 5 μL， 上 下 游 引 物 各     2 μL， 2×SuperNova     剂  (Polysciences) 进行转染。转染前将细胞分为两
              PCR Mix(Dye) 25 μL，sterile water 16 μL。反应程       组，pcDNA3.1 -HA   空载对照组及       pcDNA3.1 -HA-
                                                                                                      +
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              序：预变性       95 ℃ 5 min；变性    95 ℃ 30 s，退火        ScIFI27L2A  实验组。每组     3  个孔。每孔含有       1 μg
              65 ℃ 30 s，延伸    72 ℃ 30 s，30  个循环；总延伸            质粒，3 μL PEI 转染试剂。置于           28℃  含  5% CO 2
              72 ℃ 7 min，4℃   短期保存。采用双酶切法，使用                   细胞培养箱中转染         24 h  后换液，每孔加入        2.15×
              限 制 性 内 切 酶    Hind  Ш和  Not  І、 EcoR  І和  Not  І  10  个/mL  拷贝的  GCRV-Ⅰ型毒株 (GCRV-JX0901)
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              (TaKaRa，日本) 将真核表达载体             pcDNA3.1 -HA     10 μL，继续置于培养箱中分别培养               6、12、24、
              (在  pcDNA3.1 空载体中连接       HA  标签) 及原核表达          36  和  48 h  后收集样品。通过     RNA  提取、逆转录
                          +
              载体  PEGX-4T-1  线性化，酶切条件为        37 ℃，90 min。     及  qPCR  方法检测过表达效果及病毒结构蛋白基
              将  PCR  产物及酶切后的载体跑胶回收              (北京康润         因  (vp7、vp5、vp2) 和  IFN  通路相关基因    (ifn、irf9、
              诚业生物科技有限公司)，并使用超微量分光光度                           isg15) 的转录水平。
              计测定浓度，根据同源重组试剂盒                (南京诺唯赞生
                                                                1.7    原核表达   rScIFI27L2A、rCiIFI27L2A    重
              物科技股份有限公司) 说明书进行连接反应。反应
                                                               组蛋白的纯化与蛋白孵育
              条件为    37 ℃，30 min。连接完成后转化到大肠杆
              菌  (Escherichia coli) 感受态  DH5α (北京全式金生              按“载体构建”中所述方法构建好                PEGX-4T-
              物技术股份有限公司) 中，根据载体抗性将其分别                          ScIFI27L2A、CiIFI27L2A  原核表达载体       (去除信

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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