Page 176 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

BHI 液体培养基 (青岛高科技工业园海博生物技术 多元方差分析 (Adonis) 检验。对测量数据进行正
有限公司) 中，于 30 ℃、180 r/min 培养 24 h。当 态性和方差齐性检验。热耐性与基因表达分析采
菌 体 OD 60 0 达 到 0.8 时 ， 3 500 × g 离 心 5 min， 用双因素方差分析 (Two-Way ANOVA) ，其余指
[46]
PBS 重悬，调整浓度后用于攻毒实验。养殖实验 标使用单因素方差分析 (One-Way ANOVA) 并经
结束后，分别从各组中选取 90 尾实验鱼，攻毒组 Duncan 氏多重比较法进行差异性检验。差异显著
用 100 μL OD 600 =0.4 的复苏菌液进行腹腔注射， 性指标为 P<0.05。

PBS 注射为空白对照组 (n=90)。感染后第 9 天取
2 结果
样，第 14 天统计成活率。采集肝脏和头肾组织，
分别固定于 4% 多聚甲醛与 RNA 保存液 (RNAhold，
2.1 分离菌株 MSEF22 鉴定为粪肠球菌
北京全式金生物技术股份有限公司) 中用于后续组
织学分析和基因表达分析。 从健康大口黑鲈肠道样本中分离获得菌株
MSEF22，该菌株在 MRS 琼脂平板上 28℃ 培养
1.9 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)
24 h 后，形成圆形、湿润、表面光滑、白色菌落
采用 TRIzol 法 (RN0401，北京艾德莱生物科
(直径 0.1~1.0 mm)；在肠球菌选择性平板上形成
技有限公司) 提取总 RNA，NanoDrop 2000 检测纯
干燥、棕色菌落，培养基颜色加深。菌落未出
度 (OD 260/28 0 为 1.8~2.0)，1% 琼脂糖凝胶电泳检测 现溶血环，革兰氏染色呈阴性。MSEF22 可发酵
完整性。每 3 份 RNA 等量合并混样 (每份含1 μg
葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和甘露醇，能水解
RNA)，使用 EasyScript All-in-One 反转录试剂盒
®
淀 粉 ， 但 不 产 生 硫 化 氢 (H S)。 16S rRNA 基 因
2
(北京全式金生物技术股份有限公司) 合成 cDNA。
序 列 分 析 显 示 ， MSEF22 与 粪 肠 球 菌 JCM5803
RT-qPCR 采用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒
(NR_040789.1) 相似性为 98.62%。系统发育分析显
(北京艾德莱生物科技有限公司) 在 ABI 7 300 仪器
示，MSEF22 与 JCM5803 聚为一支，且自展支持
(Applied Biosystems，美国) 上进行，设置 3 个技
率为 100% (图 1)，表明其系统进化关系高度保守。
术重复。每次反应设置空白对照，熔解曲线分析 综上分析表明，菌株 MSEF22 为粪肠球菌。
确认扩增特异性。以延伸因子 1α (EF-1α) 为内参
2.2 MSEF22 菌株的对温度和胃肠环境的耐
基因 (表 1)，使用 2 −∆∆C t 法 [42] 计算相对表达量。
受性
表 1 本研究中所用的引物序列
随着温度升高，MSEF22 菌落总数显著下降
Tab. 1 primer sequences used in the current study
(P<0.05)，但在 50℃ 处理 30 min 后仍保持 3.62×
引物名称 引物序列(5’-3’) 参考文献 8 的菌落总数 (图 2-a)。在 28℃ 胃液模
primer name oligonucleotide sequence (5′-3′) references 10 CFU/mL
EF-1α Forward TGCTGCTGGTGTTGGTGAGTT [43] 拟 环 境 中 ， MSEF22 菌 落 总 数 在 3 h 显 著 下 降
8
Reverse TTCTGGCTGTAAGGGGGCTC (P<0.05)，为 3.55×10 CFU/mL(图 2-b)。而在肠液
IL-1β Forward CGTGACTGACAGCAAAAAAGAGG [44] 模 拟 环 境 中 ， 其 菌 落 总 数 随 时 间 显 著 下 降
8
Reverse GATGCCCAGAGCCACAGTTC (P<0.05)，至 3 h 时降至 2.94×10 CFU/mL(图 2-c)，
TNF-α Forward CTTCGTTCTACAGCCAGGCATCGC [44] 表明其对胃肠环境具有一定耐受能力。
Reverse TTTGGCACACCGACCTCACC
2.3 富硒粪肠球菌的结构特征

MSEF22 在不同浓度 Na SeO 的 3 MRS 培养基
2
1.10 统计分析
中培养 24 h 后发现，在浓度为 30 μg/mL 时培养
所有数据以“平均值±标准误”(mean±SE) 表 液 呈 红 色 ， 提 示 其 形 成 了 硒 纳 米 颗 粒 。 随 着
3
示，3 个独立生物重复进行统计分析。除特别说 Na SeO 浓度升高 (30~70 μg/mL)，硒转化效率呈
2
明外，分析 u 均在 Excel 2019 及 GraphPad Prism 浓度依赖性下降趋势，其中 30 μg/mL 处理组转化
9.0 软 件 中 完 成 。 α 多 样 性 指 数 组 间 比 较 采 用 效率最高，为 25.28%。
Kruskal-Wallis H 检验 [45] 。PCoA 分析基于属水平 微观结构分析显示，富硒培养并未改变菌体
Bray-Curtis 距离，组间 β 多样性差异使用非参数 形态，Na SeO 被转化为粒径为 30~200 nm 的球形
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https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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