Page 175 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 张 韵，等：富硒粪肠球菌对大口黑鲈生长性能、肠道菌群稳态与抗病能力的影响 50 卷

使用 16S rRNA 通用引物 (27F 与 1492R) 进行 算成活率。每日监测并记录水质指标，包括非离
[37]
PCR 扩增，方法参考 Yi 等 。PCR 产物由武汉擎 子氨、pH、水温和溶解氧。
科生物科技有限公司进行纯化与测序，所得序列 实验结束前，鱼类停止投喂 24 h，随后从每
利用 NCBI BLAST 数据库进行初步比对鉴定，并 组随机选取 90 尾鱼 (每重复 30 尾) 称重，并计算
采用 MEGA X 软件中 ClustalW 算法构建邻接法 增重率 (WGR)：
(NJ) 系统发育树，进行 1 000 次自展法 (Bootstrap) 增重率 (WGR，%) = (W − W )/W × 100%；
t 0 0
重抽样评估序列相似性与差异性 。 式中，W 和 0 W 分别为初始鱼体重和终末鱼体
[38]
t
重 (g)。
1.3 分离细菌的耐受性实验
使用无菌 1 mL 注射器从鱼尾静脉采集血液
胃液耐受性实验 菌悬液于 28 ℃ 条件下
样本，离心后收集血清并置于−80 ℃ 保存待测。
置 于 HCl-胃 蛋 白 酶 缓 冲 液 (9.5%~10.5% HCl +
采集肠道、肝脏及头肾组织，无菌操作后置于液
0.01 g/mL 胃蛋白酶，pH 2.5) 中孵育 0~3 h；
氮中速冻，后转移至−80 ℃ 保存。
肠液耐受性实验 菌悬液置于 PBS-胰蛋
1.6 血清生化指标和肝脏抗氧化能力的测定
白酶-胆盐缓冲液 (PBS + 10 g/L 胰蛋白酶 + 3 g/L
胆盐，pH 6.8) 中于 28 ℃ 孵育 0~3 h； 测定血清中谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶
热耐受性实验 菌悬液在 28、50 及 80 ℃ (AST)、总胆固醇 (TCHO)、高密度脂蛋白胆固醇
水浴中分别孵育 3、5、10、30 min。 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、碱性磷
菌落总数计算公式： 酸酶 (AKP) 等指标。制备 10% 肝组织匀浆液，检
菌落总数 (CFU/mL)=(平均菌落数×稀释倍数)/ 测超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽 (GSH) 和过
取样体积 (mL) 氧化氢酶 (CAT) 等抗氧化指标。所用试剂盒购自
南京建成生物工程研究所，严格按说明书操作。
1.4 富硒菌株培养条件优化
1.7 肠道菌群 16S rRNA 基因测序与分析
将活化后的菌株接种于不同 Na SeO 浓度 (0、
3
2
10、 20、 30、 40、 50、 60、 70 μg/mL， pH 7.5~ 养殖实验结束后，分别从对照组、EF 组和
8.0) 的 MRS 培养基中，于 28℃、180 r/min 条件 EFSe 组取 4 尾实验鱼完整肠道组织，去除肠道内容
下振荡培养 24 h。记录菌液颜色变化，并按 Yang 物，用预冷的无菌 PBS 冲洗肠道表面，液氮速冻
®
等 [39] 方法测定硒转化率。采用透射电子显微镜 研 磨 后 ， 使 用 E.Z.N.A. tissue DNA Kit (D3396，
(TEM) 观察其形态结构，并利用扫描电镜-能谱分 Omega Bio-tek Inc，美国) 提取完整肠道组织总
析 (SEM-EDS) 对其元素组成进行分析。 DNA，采用 NanoDrop 2000 光谱仪 (Thermo Fisher
Scientific，美国) 检测纯度。利用通用引物 338F
1.5 养殖实验
(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-
正式实验开始时，将驯化后的大口黑鲈随机
GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 扩增细菌 16S
分为 3 个处理组，每组 3 个重复，每个重复放养
rRNA V3~V4 区。PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶纯
40 尾，实验周期为 42 d。养殖条件为个圆形玻璃
化 (上海玉华生命科技发展有限公司)，通过 Qubit
钢水槽 (直径 1.5 m，水深 1.0 m)。商业配合饲料
4.0 定量。每 3 个样本等质量混合，构建测序文库
由武汉大北农水产科技有限公司提供，主要营养
(n=4)，采用 Illumina Nextseq2000 平台进行 2×300
成分为粗蛋白≥46.1%，粗脂肪≥8.2%，粗纤维≤
bp 双端测序，测序及数据质控由上海美吉生物医
3.7%，粗灰分≤7.2%。对照组 (control) 饲喂基础
药 科 技 有 限 公 司 完 成 。 α 多 样 性 指 数 (Chao1、
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饲料；EF 组：基础饲料中添加 1 × 10 CFU/g 的粪
Sobs、Shannon、Simpson)、β 多样性、主坐标分
肠球菌 MSEF22；EFSe 组：基础饲料中添加 1 ×
析 (PCoA) 和 线 性 判 别 分 析 (LEfSe) 在 Majorbio
10 CFU/g 的富硒粪肠球菌 EFSe，硝化后的样品 [40-41]
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Cloud 平台 (https://cloud.majorbio.com) 完成。
采用原子荧光光度计测定 Se 含量为 0.76 mg/kg。
1.8 攻毒实验
每日投喂 2 次 (8:00 和 17:00)，投喂量为鱼体重的
2%。每天观察鱼体健康状况，记录死亡情况并计 将鰤诺卡氏菌 (菌株编号 B20200819) 接种于
中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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