Page 197 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 黄晓曼，等：食源性铁过载诱导草鱼肝细胞的损伤机制 50 卷

WGR(%) = (W t −W 0 )/W 0 ×100% DA 和 FeRhoNox-1 孵育 30 min，并通过荧光显微
镜记录结果；最后使用 ImageJ 软件分析荧光显微
SGR(%) = ln(W t −W 0 )/t×100%
镜图像的平均荧光强度。
LGR(%) = (L t −L 0 )/L 0 ×100%
1.8 数据分析
式中，t 为投喂天数，W 为初始体重 (g)，W 为实
0
t
验第 t 天的体重 (g)；L 为初始体长 (cm)，L 为实 使用 GraphPad Prism 8.1 和 SPSS 17.0 软件对
0
t
数据进行单因素方差分析 (ANOVA)。所示数据代
验第 t 天的体长 (cm)。
表了 3 个独立实验的平均值。
1.4 组织学观察
2 结果
为了解食源性铁过载对草鱼肝脏的影响，分
别从 0、400、800 mg/kg 组中采集肝脏组织，并
2.1 日粮中富马酸亚铁的增加对草鱼生长性能
用 4% 多聚甲醛固定至少 12 h。随后，送塞维尔
和肝脏的影响
生物科技有限公司进行石蜡包埋以及苏木精-伊红
(H.E) 染色，在显微镜下观察肝脏组织的结构变化 为研究不同浓度富马酸亚铁对草鱼生长的影
情况，使用 Adobe Illustrator 软件标出损伤部位。 响，在饲喂持续 60 d 后，记录草鱼的体重和体长，
并分别计算各组在实验结束时的 WGR、SGR 和
1.5 细胞系和细胞培养
LGR。中铁浓度组和高铁浓度组与低铁浓度组相
草鱼肝细胞 L8824 由华中农业大学苏建国教
比，WGR 和 SGR 没有显著性变化，但高铁浓度
授捐赠。细胞于含 10% 胎牛血清、100 μmol/L
组的 LGR 显著降低(P＜0.05) (图 1)。H.E 染色结
青霉素和 100 μmol/L 链霉素的 M199 培养基中培 果显示，低铁浓度组的草鱼肝脏结构完好，细胞
养，并置于含有 5% CO 的 2 28 ℃ 培养箱中。 排列有序；中铁浓度组开始出现细胞空泡化现象，
1.6 总 RNA 提取和实时荧光定量 PCR 分析 而高铁浓度组的细胞空泡化现象更加严重，肝脏
组织结构受到明显损伤 (图版Ⅰ)。
根据 SYBR 实时荧光定量 PCR 试剂盒说明
书 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，使用定 2.2 高浓度富马酸亚铁诱导草鱼肝脏的氧化损伤
量实时聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 检测所收集样 为了探究日粮中添加过量富马酸亚铁对草鱼
品中相关基因的表达情况。简言之，在 12 孔板中 体内铁含量及氧化应激的影响，首先检测了鱼的
过夜培养的 L8824 细胞，分别用不同浓度的 FAC 血清铁含量、总铁结合力 (TIBC) 和红细胞压积
(0、250、500 μmol/L) 处理 6 和 12 h 后收集。随 (PCV) 的变化，随后检测了血清和肝脏中的相关
后，通过 RNAiso 试剂 (TaKaRa，大连) 从处理过 损伤指标及抗氧化酶活性。结果显示，虽然血清
的 L8824 细胞和肝脏组织中提取总 RNA，以检测 铁含量无显著性差异 (P＞0.05)，但呈上升趋势
靶 mRNA 的表达水平。根据制造商说明书 (南京 (图 2-a)。TIBC 随富马酸亚铁浓度增加先上升后下
诺 唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 )， 将 提 取 的 总 降，且与低铁浓度组相比差异极显著 (P＜0.01，

RNA 逆转录为 cDNA，接着对所得的 cDNA 进行 图 2-b)。PCV 在高铁浓度组与低铁浓度组存在极
qRT-PCR 分析。qRT-PCR 循环程序：95 °C 5 min， 显著差异 (P＜0.01)，而中铁浓度组则无显著性差
随后进行 95 °C 15 s 和 60 °C 30 s 的 40 次循环。 异 (P＞0.05，图 2-c)。图 2-d~f 显示，随着日粮中
所有反应设置 3 个重复，以 β-actin 作为内参基因， 铁浓度的升高，血清中的脂质过氧化产物丙二醛
采用 2 −∆∆C t 法计算基因表达差异。 (MDA) 含量显著降低，谷丙转氨酶 (ALT) 和谷草
转氨酶 (AST) 的活性极显著升高 (P＜0.01)。高铁
1.7 细胞 Fe 、总 ROS 的检测
2+
浓度组血清中过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧
经过 FAC 孵育后，检测 L8824 细胞中的 Fe 2+ 化物酶 (GPX4) 活性极显著升高 (P＜0.01)，而中
和 ROS 水平，包括总 ROS、脂质过氧化和线粒 铁浓度组则无显著性差异 (P＞0.05)(图 2-g~h)。随
体 ROS。 将 L8824 细 胞 (4×10 个 /mL) 接 种 于 6 着日粮中富马酸亚铁含量的增加，草鱼肝脏中的
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孔板中，过夜培养，之后分别用 FAC (0、250、 铁含量极显著升高 (P＜0.01，图 2-i)。肝脏中的
500 μmol/L) 孵育 6 和 12 h。使用荧光探针 DCFH- MDA 含量随铁浓度增加而升高，高铁浓度组差异

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