Page 26 - 《水产学报》2025年第12期

李伟嘉，等 水产学报, 2025, 49(12): 129602

订购于上海吉玛制药技术有限公司，以无义 体系加入电转杯 (BEX，日本) 通过电转化仪
siRNA 序列作为阴性对照。 (CUY-21 EDIT II；BEX，日本) 实现操作。电
seipin-GFP 质粒构建与提取是建立在克隆 转后将细胞接种至 12 孔板或 6 孔板中，siRNA
得 到 的 斑 马 鱼 seipin CDS 基 础 上 ， 使 用 干扰实验和 seipin-GFP 实验分别于培养 24 h 和
®
pEASY -Basic Seamless Cloning and Assembly Kit 36 h 后收集样品。
(北 京 全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司 ) 将 其 与
1.6 RNA 的提取及 cDNA 的合成
pcDNA3.1-EGFP 连接，测序并进行序列比对得
到 seipin-GFP 菌液。在 12.5 mL 灭菌的 LB 肉汤 使用 TRIzol 试剂 (南京诺唯赞生物科技股
培养基中加入 100 μL 菌液，于摇床上过夜，参 份有限公司) 提取斑马鱼肝脏和肝细胞总 RNA，
数设置为 37 ℃，200 r/min。使用无内毒素质粒 并测定总 RNA 的浓度和质量，分别使用 Nano-
小提中量试剂盒 [ 天根生化科技 (北京) 有限公 drop 2000 (Thermo Fisher Scientific，美国) 和琼
®
司 ] 提取质粒。 脂糖凝胶电泳。按照说明书采用 Hiscript Ⅲ RT
电转前 12 h，将斑马鱼肝细胞培养基更换 Supermix for qPCR Kit (南京诺唯赞生物科技股
为不含抗生素、含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养 份有限公司) 合成 cDNA。
基。电转时，使用 l 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 清
1.7 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)
洗、胰蛋白酶消化细胞，并将细胞收集于 2 mL
上述培养基中，离心弃去培养基，将细胞重悬 在定量热循环仪 (CFX96TM Real-Time Sys-
于 OPTI-MEM 培养基 (Invitrogen，美国) 中，重 tem) 中 对 靶 基 因 (表 1) 进 行 RT-qPCR。 按 照
复上述步骤 2 遍。将 25 μL 含约 1×10 个细胞 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试 剂
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的 OPTI-MEM 培养基与 15 μL 含 5 μg 的 siRNA 盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司) 要求进
或 3 μg 的 seipin-GFP 质粒的 OPTI-MEM 培养基 行操作。反应完成后进行熔解曲线分析来确认
配成电转体系。随后将 40 μL 吹打混匀的电转 PCR 产物的特异性。基因表达以 β-actin 为内参

表 1 用于克隆和 RT-qPCR 的引物序列
Tab. 1 Primer sequences for cloning and RT-qPCR
引物 序列 信息
primer sequence information
seipin-F ATGGGCGCAGCAATGGGACC 克隆引物 cloning primer
seipin-R TTATGTAATATTTTTACCAGTTTCA 克隆引物 cloning primer
qβ actin-F TCTGGTGATGGTGTGACCCA RT-qPCR
qβ actin-R GGTGAAGCTGTAGCCACGCT RT-qPCR
qseipin-F ATTGTTGGAGTGGCGAGTA RT-qPCR
qseipin-R CGAACGGTTTGTTTGGGAT RT-qPCR
qDGAT1A-F GCTTATCTATGACTGGAACAC RT-qPCR
qDGAT1A-R CAGGTTATGCGTCTTGATG RT-qPCR
qDGAT1B-F AGTACCAGGAGCGAGTCTGT RT-qPCR
qDGAT1B-R GAGCTGCAAGTTTTTCGCCA RT-qPCR
qDGAT2-F ACGCATAACCTGCTTCCC RT-qPCR
qDGAT2-R TCCTGTGGCTTCTGTCCC RT-qPCR
qMTP-F GTGAAGGCTCTGGATGAC RT-qPCR
qMTP-R TCTGGGCTGATGTTACTG RT-qPCR
qATGL-F AACTCATCCAGGCTCTCAT RT-qPCR
qATGL-R TTCCACCATCCACATAACG RT-qPCR
qLPL-F AAGATGCACGGCAGTTCATTC RT-qPCR
qLPL-R CTCCTGGACTTGGGTTGGGT RT-qPCR

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