Page 25 - 《水产学报》2025年第12期
P. 25

李伟嘉，等                                                                水产学报, 2025, 49(12): 129602

                   脂滴作为细胞内调节脂类储存、代谢与转                          引物各    1 μL，2×Phanta Flash Master Mix (南京诺
              运的动态细胞器，具有特殊的超微结构。中性                             唯赞生物科技股份有限公司)12.5 μL               和 DEPC
              脂构成了脂滴的核心，其外由一层镶嵌着众多                             水  9.5 μL。PCR  仪扩增反应程序：98℃ 3 min；
                                            [3]
              蛋白质的磷脂单分子层所包围 。在脂滴相关                             98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min，35     个循环；
              的众多蛋白质中，seipin         作为重要的脂滴生成相                72℃ 10 min。PCR   产物经    1%  琼脂糖凝胶电泳
              关蛋白，最初因编码           seipin  的  bscl2  基因突变会      检测后回收目的条带，连接到                pEASY-T1  简单
              导致严重脂肪营养不良而受到重视，该疾病具                             克隆质粒     (北京全式金生物技术有限公司) 导入
              体表现为病人全身脂肪组织缺失，肝脏和肌肉                             大肠杆菌，蓝白斑筛选后将转入成功的菌液送
              出现异常脂沉积         [4-5] 。研究发现   seipin  缺失会导       基因公司测序，获得          seipin  编码序列。
              致细胞中异常的脂滴表型，即细胞内产生小而                              1.2    seipin  序列分析
              聚集的脂滴或超大脂滴             [6-7] 。研究发现，在      TG
                                                                   使 用   Expasy  ProtParam  在 线 软 件  (https://
              脂滴生成过程中，seipin          在内质网上组成共聚
                                                               www.expasy.org/resources/protparam) 分 析 斑 马
                 [8]
              体 ，共聚体内部形成的空间可能隔绝外部磷
                                                               鱼  seipin  蛋白理化性质，Expasy Protscale 在线
              脂，使    TG  分子间更易发生相互作用，为             TG  聚集
                                                               软 件   (https://www.expasy.org/resources/protscale)
                                   [9]
              成核提供一个理想平台 ，从而有助于脂滴形成。                           进行   seipin  蛋白疏水性分析，TMHMM           在线软
                   Seipin  是一个具有组织和细胞特异性功能
                                                               件  (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测
              的蛋白，目前        seipin  在脂肪组织形成和脂肪细
                                                               seipin  蛋白跨膜区。
              胞分化中的功能已被广泛报道                 [10-12] ，然而肝脏
              中  seipin  如何调控脂质储存与代谢尚处于探索                       1.3    DsRNA  合成与注射
              阶段。仅有小鼠          (Mus musculus) 中的研究发现               应用试剂盒      TranscriptAid T7 High Yield Tra-
              高脂饲喂后小鼠肝脏             seipin  表达下调，敲降            nscription Kit (Thermo fisher，美国) 合成  dsRNA，
                                                [13]
              seipin  表达后小鼠肝脏       TG  含量升高 ，而过表              dsRNA  的 浓 度 和 质 量 使 用       NanoDrop  2000
              达  seipin  可以缓解高脂饲喂诱导的小鼠脂肪肝                      (Eppendorf，德国) 检测，使用前存放于−80 ℃
                [14]
              病 。因此，seipin       可能在肝脏脂质代谢中发挥                  冰箱。本实验所用斑马鱼由中国国家斑马鱼资
              重要作用，然而其在肝脏中的作用机制尚不清楚。                           源中心    (武汉，中国) 提供，将           24  尾实验鱼    (2
                   斑马鱼    (Danio rerio) 因其全序列基因组可              月龄) 随机分成      4  组  (每组  6  尾)，以  2 μg/g 体重
              获得、养殖成本相对低廉、可产大量后代、发育                            剂量腹腔注射斑马鱼靶向              seipin  的  dsRNA，或
              快速等优点，成为了解代谢性疾病发病机制和                             等量   dsRNA  对照。注射      24 h  和  36 h  后实验鱼
              识别潜在治疗靶点的动物模型，如脂肪肝已在                             用  MS222  麻醉，取肝脏样品用于后续分析。
              斑马鱼中成功模拟          [15-16] 。鱼类是脊椎动物中种              1.4    斑马鱼肝细胞培养
              类最多样的类群，然而鱼类中关于                   seipin  调控
                                                                   斑马鱼肝细胞系购自中国国家斑马鱼资源
              肝脏脂质代谢的研究鲜有报道。因此，实验以
                                                               中心。细胞在含         10%  胎牛血清     (苏州依科赛生
              斑马鱼为研究对象，对斑马鱼                 seipin  进行基因
                                                               物科技股份有限公司) 和            1%  抗生素   (北京索莱
              克隆和序列分析，并通过敲降和过表达                      seipin
                                                               宝科技有限公司) 的         DMEM/F12   培养基    (上海逍
              探究其在斑马鱼肝脏脂质代谢中的作用，为缓
                                                               鹏生物科技有限公司) 中，在              28℃、5% CO 条
                                                                                                       2
              解鱼类肝脏脂肪异常沉积问题，提高饲料中脂
                                                               件下培养。
              肪利用率，实现水产养殖业健康发展提供思路。
                                                                1.5    斑马鱼肝细胞中     seipin  敲降与过表达
               1    材料与方法
                                                                   为了探究      seipin  在斑马鱼肝脏脂质代谢中
                                                               的作用，将       seipin-siRNA  和  seipin-GFP  质粒分
               1.1    基因克隆
                                                               别电转入斑马鱼肝细胞以敲降和过表达                     seipin。
                   以斑马鱼肝脏         cDNA  为模板进行       PCR  反     其中，针对       seipin  的  siRNA(GGACGGAAGAC-
              应，配置     25 μL  反应体系：模板       1 μL，上、下游          CUGAAUAATT/UUAUUCAGGUCUUCCGUCCTT)

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            2
   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30