Page 51 - 《水产学报》2025年第11期
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胡利，等                                                                 水产学报, 2025, 49(11): 119105

              海水组 (SW) 和酸化组 (OA)，每组            36  只。将在        0.2 μL、ROX 0.2 μL、10   倍稀释的     cDNA 2 μL、
              正 常 曝 气 海 水 中 培 养 的 长 牡 蛎 作 为 海 水 组              RNA free water 2.4 μL。反应程序为       95 ℃  恒温
                            [24]
              (pH=8.10±0.05) 。同时，将在空气与            CO 混合        30 s，95 ℃  恒温   5 s，60 ℃  恒温   45 s，共  40  个
                                                     2
              曝 气 的 海 水 中 培 养 的 长 牡 蛎 作 为 酸 化 组                循环。所有数据均采用             2 −∆∆C t 方法计算  mRNA
                                                                           [26]
              (pH=7.80±0.05)。 分 别 酸 化 胁 迫     3、 7、 14  和      的相对表达量 。
              28 d  后收集实验动物外套膜样品，每个时间点                              基于  HMM   模型对含有      Glyco-18  结构域的
              随机挑选     9  只，组内每     3  只混合为    1  个样品   (即     基因家族鉴定  基于            Cgchitinase 基因家族的
              1  个平行组)，共      3  个平行组。取外套膜并在体                  定义，利用隐马尔可夫模型 (Hidden Markov
              式显微镜下进行外套膜缘膜区褶皱分离，样品                             Model，HMM) 预测含       Glyco-18  结构域的蛋白
              于  1 mL TRIzol™中保存，存放于−80 ℃           超低温        序列并去除冗余。具体步骤：从                 NCBI 网站上
              冰箱中备用。                                           下载组装好的长牡蛎蛋白质数据。利用                    pfam  数
                    总  RNA 的提取和      cDNA  合成  将含有             据库中的     PF00704  模型信息，通过        HMMER    软
              TRIzol 的组织样品用冷冻研磨仪进行研磨，按                         件中的    hmmsearch  命令在蛋白组中搜索含有
              照  5∶1  体积比加入      RNA 提取辅助试剂后离心                 Glyco-18  结构域的蛋白序列。最后编写               perl 脚
              15 min。吸取上清液后加入等体积异丙醇，混                          本整理输出结果，从蛋白组文件中提取出所有
              匀后于−80 ℃      沉降   40 min，离心    15 min，去上        Glyco-18  家族蛋白序列。
              清液后加入       75%  的乙醇，上下混匀，洗涤            RNA           Cgchitinase 基因结构域、系统进化分析、
              沉淀后离心       5 min，弃去上清液，重复            75%  乙     多序列比对及       motif 位点分析  使用         SMART
              醇洗涤     1  次。干燥    RNA  后使用    DEPC  水溶解。        (http://www.smart.embl-heidelberg.de/) 进 行 基 因
              使用   Nanodrop 2000 (Gene Company Limited，中       结构域分析，并利用           MEME (https://meme-suite.
              国 )  测 定   RNA  浓 度 。 利 用     One-Step  gDNA     org/meme/tools/meme) 工具对   Cgchitinase 家族基
              Removal  and  cDNA  Synthesis  SuperMix  试 剂 盒   因 的 氨 基 酸 序 列 进 行     motif 位 点 分 析 ， 设 置
              (北京全式金生物技术有限公司) 进行                  cDNA  合      motif 数 量 为  12， 其 他 为 默 认 参 数 。 使 用
              成，整个过程严格按照制造商的说明进行。合                             NOVO Pro (https://www.novopro.cn /tools/protein)
              成反应在      42 ℃  下孵育   15 min，后在    85 ℃  下加      对  Cgchitinase 家族基因进行蛋白分子理化性质
                        [25]
              热  5 s 终止 。反转录完成后，cDNA              于−80 ℃       预测。使用      MEGA11   程序中的     MUSCLE比对工
              超低温冰箱中保存。                                        具进行多序列比对。采用最大似然法 (Max-
                    mRNA  表 达 水 平 分 析     本 研 究 利 用            imum Likelihood，ML  法)，对软体动物中 [ 头
              QuantStudio™ 6 Flex  实 时 荧 光 定 量   PCR  系 统      足纲 (Cephalopoda)、腹足纲 (Gastropoda) 和双
              (Thermo  Fisher  Scientific， 美 国 )， 通 过  RT-     壳纲 (Bivalvia)] 含有  Glyco-18  结构域的几丁质
              qPCR  技术测定     mRNA   表达水平。使用特异性                 酶家族基因进行系统发育分析，同时使用                     iTOL
              引 物   Cgamcase-1-RT-F  和  Cgamcase-1-RT-R  扩     (https://itol.embl.de/) 网站对系统发育树进行格式
              增目的基因       Cgamcase-1，CgEF    作为内参基因            调整。
              (表  1) 。RT-qPCR  反应体系总体积为          10 μL，包            染色体分布分析  本研究利用                 NCBI 中
              括  SYBR Green Master Mix 5 μL、正反引物各              的长牡蛎基因组注释数据文件。提取几丁质酶


                                                     表 1    实验所用引物
                                             Tab. 1    The primers used in this study
                           引物                                 序列                              用途
                           primer                         sequence (5′–3′)                    usage
                       Cgamcase-1-RT-F             AAGGAAAAGGAAACGCAGGG                     RT-qPCR
                       Cgamcase-1-RT- R            CCCGGAATTTGACCCAGAACT                    RT-qPCR
                       CgEF-F                      AGTCACCAAGGCTGCACAGAAAG                  RT-qPCR
                       CgEF-R                      TCCGACGTATTTCTTTGCGATGT                  RT-qPCR


              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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