Page 19 - 《水产学报》2025年第10期
P. 19

洪佳乐，等                                                                水产学报, 2025, 49(10): 109602

              进行图片捕获和观察。                                       数据用     2 (  −∆∆C t  ) 计算方法获得 [14] ，引物序列见

                                                               表  1。
              1.7    免疫荧光检测分析
                   将石蜡包埋后的后肠组织切成厚度为                   4 μm     1.9    数据分析
              的切片，分别与蛋白抗体             Zo-1(21 773-1-AP，购           采用   SPSS 27.0  软件进行数据分析，数据
              自武汉三鹰技术有限公司， zonula occludens-1)、                用平均值±标准误表示。通过              Shapiro-Wilk  检验
              Occludin(27 260-1-AP，购自武汉三鹰技术有限                  评估数据正态性，采用            Levene 检验法验证数据
              公司)、AhR(CY3 431，购自埃必威生物技术有                       方差齐性。数据经检验符合正态分布以及方差

              限公司，aryl hydrocarbon receptor)、NLRP3(CY5         齐性后，采用单因素方差分析              (One-way ANOVA)
              651，购自埃必威生物技术有限公司，nod-like                       结合  Duncan’s 多重比较法进行组间差异显著性
              receptor thermal protein domain associated protein  检验，P < 0.05  表示差异显著。实验数据可视化
              3)、Hif-1α(CSB-RA 263 943A0HU，购自武汉华               通过  GraphPad Prism 6.0  软件实现。

              美 生 物 ， hypoxia  inducible  factor-1α)、 VDAC1
              (CY5 416， 购 自 埃 必 威 生 物 技 术 有 限 公 司 ，            2    结果

              voltage-dependent anion channel 1)、LAMP2(CY5
                                                               2.1    β-伴大豆球蛋白刺激对杂交黄颡鱼后肠组
              518，购自埃必威生物技术有限公司，lysosomal-
              Associated Membrane Protein 2) 于  4 °C  共孵育过     织形态和微结构的影响
              夜，然后用山羊抗兔         IgG  二抗  (1∶200，#PN0046，           β-伴大豆球蛋白剂量依赖性引起杂交黄颡
              皮诺飞生物)37 °C       孵育   1 h，DAPI 室温避光染            鱼后肠豆粕诱导型肠炎，表现为炎性细胞浸润，
              核  5 min，滴加抗荧光封片剂封片。利用数字切                        黏膜褶皱长度剂量依赖性变短，黏膜褶皱宽度
              片扫描仪      (Pannoramic Midi，3DHISTECH)捕获          和固有层宽度以及黏膜下层宽度剂量依赖性变
              图像并观察，利用           ImagePro Plus 6.0 软件量化        宽等，以      4 mg/kg  处理组最为严重        (P < 0.05，
              荧光强度。                                            图版  I 和图  1-a)。

              1.8    基因表达分析                                        与对照组相比，1          和  4 mg/kg  处理组黄颡
                                                               鱼后肠上皮细胞微绒毛显著变短                (图版  II 和图  1-
                   采用   Trizol(TransZol，ET 101-01-V2，北京
                                                               b)，细胞间隙增大，顶端连接、黏附连接和桥
              全式金生物技术有限公司) 法提取样品                     RNA，
                                                               粒变的短而模糊。线粒体肿胀、断裂、空泡化，
              用紫外分光光度计          (840-317 500，Thermo Fisher
                                                               线粒体嵴变短或消失、双层膜结构受到显著破
              Scientific) 检测  RNA  样品的纯度和浓度，用琼
                                                               坏，以    4 mg/kg  最为严重   (图版  II)。
              脂糖凝胶      (1%) 电泳检测     RNA  的完整度。利用
              HiScript III RT SuperMix for qPCR(R 323-01，购     2.2    β-伴大豆球蛋白刺激对杂交黄颡鱼后肠组
              自江苏诺唯赞生物科技有限公司) 将检验合格的                           织氧化应激的影响
              样品总    RNA  逆转录成互补        DNA(cDNA)。以      β-        β-伴大豆球蛋白刺激引起杂交黄颡鱼后肠
              actin  和  ef1α  为内参基因，利用 ChamQ Univer-           组织氧化应激水平显著升高。后肠                   MDA  含量
              sal SYBR qPCR Master Mix(Q 711，购自江苏诺             剂量依赖性上升，以           4 mg/kg  处理组最高      (P <
              唯赞生物科技有限公司) 在             ABI 7 300 Fast Real-   0.05， 图  2-a)。 后 肠  ROS  含 量 在 各 刺 激 组 间
              time PCR System ( Thermo Scientific, USA) 上参     无显著性差异，但显著高于对照组                   (P < 0.05，
              照本实验室前期建立的方法              [13]  进行  RT-qPCR  反   图  2-b)。

              应。反应体系：2 × ChamQ SYBR qPCR Master
                                                               2.3    β-伴大豆球蛋白刺激对杂交黄颡鱼后肠组
              Mix 5.0 μL，cDNA (200 ng/µL) 2.0 μL，上下游
                                                               织炎性因子表达的影响
              引物各 0.2 μL，ddH O 补至 10.0 μL。反应程序：
                                 2
              95 °C  预变性   10 min，40  个循环    (变性：95 °C、            β-伴大豆球蛋白刺激显著引起杂交黄颡鱼
              15 s，退火：60 °C、15 s，延伸        72 °C、30 s)，溶       后肠组织炎症，表现为髓过氧化物酶活性、促
              解曲线     (95 °C 15 s，60 °C 1 min，95 °C 15 s)。     炎因子    IL-1β  蛋白含量及     mRNA  表达水平剂量

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            4
   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24