Page 18 - 《水产学报》2025年第10期
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洪佳乐，等                                                                水产学报, 2025, 49(10): 109602

              0.8 m，有效水体积约：576 L) 中暂养            7 d。暂养        于细胞超微结构分析。除用于组织病理学分析
              期间，每日于        08:30  和  18:30  进行饱食投喂    1 h。    和细胞超微结构分析样品保存于 4 °C                外，所有
              暂 养 期 间 水 温 维 持 在      24~26 °C， 溶 解 氧 ＞ 5       样本均经液氮速冻后转入−80 °C              超低温冰箱保
              mg/L，氨氮＜0.01 mg/L。暂养饲料由本实验室                      存待测。

              自主配制，蛋白水平为              43.22%，脂肪水平为
                                                               1.4    组织病理学分析
              8.88%，鱼粉含量为        40%。

                                                                   后肠组织经       4%  多聚甲醛固定       48 h  后，依
              1.2    β-伴大豆球蛋白刺激
                                                               次 置 于 梯 度 乙 醇      (70%、 80%、 90%、 95%、
                   暂养结束后，对实验用鱼进行                24 h  禁食处      100%) 中逐级脱水后，利用二甲苯透明并用石
              理，然后选取表观健康，体重规格为                      (5.11 ±    蜡包埋。包埋完成后修整蜡块，利用切片机连
              0.52) g  的健康杂交黄颡鱼        225  尾，随机放入      15     续切片，切片厚度         4 μm。经展片、贴片、脱蜡、
              个养殖缸      (规格   0.5 m×0.4 m×0.3 m，水体积     60     反向复水后进行苏木精-伊红染色。染色完成后，
              L)，每缸    15  尾鱼。分别按照        0、0.5、1.0、2.0、       经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后滴加中性
              4.0 mg/kg  鱼体重的注射剂量将实验分             5  个处理       树脂封片。利用光学显微镜               (Pannoramic Midi，
              组，分别记为：对照组             (control 组)、0.5 mg/kg     3DHISTECH，Hungary) 捕获肠道组织图像，使
              β-伴大豆球蛋白刺激组           (0.5 mg/kg  组)、1 mg/kg     用  Motic Digital Slide Assistant Lite1.0  软件分析
              β-伴大豆球蛋白刺激组           (1 mg/kg  组)、2 mg/kg β-    肠道形态学参数，包括：黏膜褶皱长度                       (the
              伴大豆球蛋白刺激组            (2 mg/kg  组)、4 mg/kg β-     length of intestinal mucosal fold，LMF)、黏膜褶
              伴大豆球蛋白刺激组           (4 mg/kg  组)。                皱宽度    (width of the submucosa，WMF)、固有层
                   β-伴大豆球蛋白刺激方式为后肠注射，具                         宽度   (width of the lamina propria，WLP)、黏膜
              体操作方法：配制质量浓度为                 60 mg/L  间氨基       下层宽度      (thickness of circular muscle，WSM)。
                                                                                     [12]
              苯甲酸乙酯甲磺酸盐            (3-aminobenzoic acid ethyl  具体测量方法参考         Yi 等 。

              ester methanesulfonate，MS-222) 的麻醉液对各            1.5    后肠活性氧、丙二醛、髓过氧化物酶和细
              处理组实验用鱼进行麻醉，精确测量每尾鱼的                             胞因子检测
              体质量。配制体积浓度为               10 mg/mL  的  β-伴大
                                                                   后肠组织中活性氧          (reactive oxygen species，
              豆球蛋白母液，采用微量注射器按照                    5 uL/g  鱼
                                                               ROS) 水 平 、 丙 二 醛    (malondialdehyde， MDA)
              体重的注射剂量分别将母液稀释至相应浓度，
                                                               含量、髓过氧化物酶            (myeloperoxidase，MPO)
              按照每尾鱼体重取适量稀释液采用后肠注射法                             活性利用购自南京建成生物工程研究所的检测
              注射至各处理组鱼体后肠，对照组注射相应剂                             试剂盒   (货号分别为      E004-1-1、A003-1-2、A044-
              量的生理盐水。注射完毕，将各处理组实验鱼                             1-1)，根据说明书操作方法进行。
              重新放回原养殖缸。                                            后肠组织中促炎因子            IL-1β、抗炎因子      IL-

              1.3    样本采集                                      10(interleukin 10，IL-10) 的含量，采用酶联免疫
                                                               试剂盒    (货号分别为       KQ 139942、KQ 109400，
                   β-伴大豆球蛋白刺激          24 h  后，记录各缸实
                                                               上海柯桥生物科技有限公司) 按照说明书进行操
              验鱼存活数，并采集后肠组织样本。样本采集
                                                               作测定。

              具体操作步骤为：从每个养殖缸中随机选取 13
              尾鱼，经      MS-222(60 mg/L) 麻醉后采集后肠组               1.6    透射电镜观察
              织样本。3      尾鱼的后肠组织用 4% 多聚甲醛溶                         透射电镜观察用后肠组织样本经                   2.5%  戊
              液固定，用于        H.E  染色和免疫荧光分析；3            尾      二醛室温避光固定         2 h，依次经梯度乙醇及丙酮
              鱼的后肠组织用于氧化应激指标测定；3                      尾鱼       脱水后，包埋于树脂中，60 °C             聚合   48 h。超薄
              的后肠组织用于炎性相关指标检测分析；3                       尾      切片机    (PT-PC，RMC) 切成厚度为        60 nm  切片，
              鱼的后肠组织用于相关指标               mRNA   表达水平分          铜网捞取。2%       醋酸铀和     2.6%  柠檬酸铅染色后，
              析，1   尾鱼的后肠组织用          2.5%  戊二醛保存，用            通过透射电子显微镜            (HT7 700, Hitachi, Japan)

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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