Page 53 - 《水产学报》2025年第8期
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石今朝，等                                                                 水产学报, 2025, 49(8): 089405

              蟹。本研究获得了上海海洋大学动物福利伦理                             序分析；另一只蟹的后肠，切成              3~5 mm  小段，放
              委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守上                             入装有    1 mLBouin's 固定液的无酶离心管中，常
              海海洋大学实验动物伦理委员会规范，并按照                             温保存，以备后续组织切片。

              上海海洋大学伦理委员会制定的规章制度执行。
                                                               1.5    肠道组织分析

              1.3    理论安全浓度值和慢性暴露实验
                                                                   参考姚桂桂等       [19]  的方法，进行肠道组织切
                   根据预实验结果，配制             0.60、1.01、1.69、      片，通过苏木素-伊红           (H.E) 染色，中性树胶封
              2.84、4.77、8.00 μg/L 溴氰菊酯溶液进行急性毒                  片，Eclipse 80i 显微镜    (Nikon，日本) 进行组织
              性实验， 探究溴氰菊酯对中华绒螯蟹的安全浓                            观察、拍照。

              度  (SC)，溶剂对照组添加等体积丙酮溶剂                    (通
                                                               1.6    肠道微生物群分析方法
              过稀释母液使各实验组水槽中丙酮的体积相同)，
              空白对照组不添加溴氰菊酯。每组设置                     3  个平          DNA  提取与     PCR  扩增  中华绒螯蟹肠
                                                               道中的    DNA  提取参照      E.Z.N.A.  Soil DNA Kit
                                                                                             ®
              行，每个平行         10  只实验蟹。实验在 60 cm×
                                                               (Omega Bio-tek, Norcross, 美 国 ) 说 明 书 进 行 。
              60 cm×25 cm 玻璃水族箱中进行，水体体积为
              40 L，40 W   日光灯光照维持        12 h  光照∶12 h  黑      DNA  质检合格后，采用          16S rRNA  全长通用引
                                                               物   27F： 5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3'
              暗，维持水温         (22±1)℃、pH 7.2~7.6、溶解氧
                                                               和  1492R： 5'-RGYTACCTTGTTACGACTT-3'进
              >5.00 mg/L。每隔     24 h 各组分别替换与原实验
                                                               行  PCR  扩增，扩增产物经         2%  琼脂糖凝胶电泳
              体积相同的水体         (同温)，实验时间为 96 h，实
              验期间不投食。每隔           24 h  记录各水族箱的中华              分 离 ， 通 过  AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit
                                                               (Axygen Biosciences, 美国) 进行纯化。
              绒螯蟹死亡数量，及时捞出死亡中华绒螯蟹。
                                                                   文库构建及测序  根据生产商                    Pacific
              判断中华绒螯蟹死亡方法为眼柄和触角停止运
                                                               Biosciences 操作提示，通过平端连接从扩增的
              动。根据      Turubell 公式，计算出水体溴氰菊酯
              的安全浓度为        0.19 μg/L。                         DNA  中制备    SMRTbell 文库。Zymo      和  HMP  模
                                                               拟 样 本 纯 化 后 的    SMRTbell 文 库 ， 使 用    S/P1-
                   慢性胁迫实验采用           4  个溴氰菊酯胁迫组，
              分别为溶剂对照组           (添加等体积的丙酮)、2           个      C1.2  测序试剂在单个专用的            PacBio Sequel cell
                                                               上测序，并验证样品的生物学重复。所有扩增
              低于安全浓度的实验组               (1/8 SC：0.024 μg/L、
                                                               子测序均由上海凌恩生物科技有限公司承担。
              1/2 SC：0.950 μg/L) 和阳性对照实验组           (2×SC，
                                                                   测序数据处理  使用              SMRT Link Ana-
              0.380 μg/L)，每个浓度组设         4  个平行，每个平
                                                               lysis 软件  6.0  版处理  PacBio  原始读序     (reads)，
              行  10  只实验蟹，共计        160  只。每日    16:00  投喂
                                                               以获得环形一致性序列            (CCS) reads：参数设置
              澳华   3#扣蟹饲料，投喂量为扣蟹总重的                2%~3%，
                                                               最 小 通 过 次 数 =3， 最 小 预 测 准 确 度 =0.99。
              4 h  后用虹吸管将残饵吸出。每              24 h  换掉水槽
                                                               reads 通过  SMRT Portal 处理，以筛选序列的长度
              中全部的水，并用母液调整溴氰菊酯的浓度，
                                                               (>2 500 bp)。通过去除标签        (barcode)、引物序
              水质条件控制与急性毒性实验相同，实验共持
                                                               列、嵌合体和包含         10  个连续相同碱基的序列进
              续     30 d。
                                                               行过滤。使用      UPARSE   软件  (7.1  版，http://drive5.
              1.4    样品采集
                                                               com/uparse/) 将操作分类单元      (OTU) 按照   98.65%
                   暴露   0 和  30 d  后分别进行采样。采样前，                的相似性阈值聚类，并使用              UCHIME   鉴定并去
              所有实验蟹均饥饿处理             24 h，每个平行随机抽              除 嵌 合 序 列 。 使 用      RDP  Classifier  (http://rdp.
              取采样    2  只蟹。将蟹取出后，用吸水纸擦拭蟹                       cme.msu.edu/) 软 件 针 对    Silva  (SSU132)  16S
              体表的水分，然后使用电子天平                 (0.01 g) 称量并      rRNA  数据库，使用       70%  的置信度阈值分析每
              记录扣蟹的体重。从侧面分开蟹壳与躯体，用                             个  16S rRNA  基因序列的系统发育关系             [20] 。基
              镊子取出所有肠道，于冰上分别截取                    2  只扣蟹       于  Mothur v.1.21.1  软件进行的稀释曲线分析，
              的后肠：取       1  只蟹的后肠放入       1.5 mL  无酶离心        以揭示    Chao1、ACE   和  Shannon  等多样性指数。
                                                                                                    [21]
              管中，保存在−80 ℃         超低温冰箱，以备后续测                  利用  SPSS 23.0  软件进行统计学差异分析 。

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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