Page 20 - 《水产学报》2025年第8期
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黄泽翔，等                                                                 水产学报, 2025, 49(8): 089102

              GR  与糖皮质激素受体反应元件 (glucocorticoid                 敏感性和高特异性。因此，本实验运用                      RNA-
              response elements, GREs) 结合，调节靶基因的转              scope 原位杂交技术开展         gr1  和  gr2  基因在克氏
              录活性 。                                            双锯鱼大脑中的表达分布研究，探讨糖皮质激
                     [1]
                   糖皮质激素是介导应激轴对生殖轴调控的                          素及其受体      GR  可能参与的生理活动，为丰富
              关键因子，通过         GR  直接作用于大脑，诱导由                  脊椎动物内分泌网络提供重要的理论依据。

                                                [3]
              应激引起的行为和神经内分泌反应 。对斑马
              鱼 (Danio rerio) 的研究发现，糖皮质激素可以                    1    材料与方法

              促进其卵母细胞成熟、排卵和胚胎发育 。同
                                                     [4]
                                                               1.1    实验动物和样品处理
              时，糖皮质激素参与了硬骨鱼类性别分化过程。
              高温胁迫引起的皮质醇的水平升高，能诱导牙                                 在海南省海口市琼山区水产市场购买野生
              鲆 (Paralichthys olivaceus) 和青鳉 (Oryzias latipes)  的克氏双锯鱼 (体长：8.3~10.5 cm，体重：25.2~
              未分化的性腺发育成精巢，而非卵巢                   [5-6] 。在性     34.3 g，n=12)，置于室内海水循环养殖圆桶 (高
                                                               度：100 cm，直径：80 cm) 暂养          1  周，水温保
              逆转过程中，眼斑双锯鱼 (Amphiprion ocellaris)
                                          [7]
              血浆中的皮质醇水平显著升高 。提示，糖皮质                            持在   26~28 ℃，光照周期       12 h  光照 (8：00~20：
              激素在性腺分化和性腺发育成熟中起重要作用。                            00)，12 h  黑暗。每天     2  次定时定点 (8：30，17：
                   糖皮质激素还参与了学习记忆、应激反应                          30) 投 喂 商 业 饲 料 。 实 验 鱼 用      0.05% MS-222
                                         [8]
              以及渗透压调节等生理活动 。在大鼠 (Rattus                        (Sigma，美国) 麻醉后，用无菌的手术刀和镊子
              norvegicus) 和松鼠猴 (Saimiri sciureus) 中，通过         小心取出全脑组织，放入               4%  多聚甲醛溶液
              免疫组化和原位杂交技术检测，gr 基因                   mRNA       (Biosharp，中国) 中固定     24 h。脑组织固定好后，
              阳性信号主要分布在海马体，提示其参与了记                             依次置于     10%、20%、30%     蔗糖/1×磷酸盐缓冲
              忆行为的过程       [9-10] 。近年的研究发现，下丘脑室                溶液   (PBS) (pH=7) 梯度溶液中，4 ℃ 脱水，直
              旁核 (paraventricular nucleus, PVN) 存在丰富的          至完全沉入试管底部。采用                OCT (Sakura，美
              gr 基因信号，介导糖皮质激素通过负反馈作用                           国) 包埋剂于干冰上包埋，待包埋块完全凝固变
              抑制   PVN  神经元，进而下调         HPA  轴的活性    [11-12] 。  白。组织块用冷冻切片机 (Leice, 德国) 切取         7~10 μm
              在虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 和莫桑比克罗非                全脑的冠状切面 (图         1)，将组织切片置于防脱
              鱼 (Oreochromis mossambicus) 中，GR    免疫细胞         载玻片上 (Epredia, 美国)，−80 ℃       保存备用。
              在端脑、视前区 (preoptic area, POA)、下丘脑和                    本研究获得了海南大学动物福利机构实验
              垂体高密度表达，提示皮质醇在调节鱼类的渗                             动 物 管 理 和 使 用 伦 理 委 员 会 批 准  (编 号 ：
              透压或压力等应激反应中扮演重要角色                    [13-14] 。   HNUAUCC-2021-00014)，实验过程中操作人员
                   克氏双锯鱼 (A. clarkii) 俗称双带小丑鱼，                 严格遵守海南大学动物福利机构伦理规范，并
              属于鲈形目 (Perciformes) 雀鲷科 (Pomacentridae)          按照海南大学动物福利机构伦理委员会制定的
              双锯鱼属 (Amphiprion)，是一种雌雄同体、雄性                     规章制度执行。

              先熟的社会性性逆转鱼类，其性腺发育与社会
                                                               1.2    原位杂交
              地位密切相关。在克氏双锯鱼群体中，仅存在
              一尾具有统治地位的雌性个体和一尾具有生殖                                 克氏双锯鱼        gr1 (GenBank: MN244237) 和
              功能的雄性个体。当功能雌性个体缺失时，功                             gr2 (GenBank: MN244238) 基因探针由      Advanced
              能雄性个体会经历性逆转发育为统治地位的雌                             Cell Diagnostics (美 国 ) 公 司 设 计 合 成 ， RNA-
              性 [15-16] 。团队前期对克氏双锯鱼的研究发现，非                     scope 探针通道参照本实验室之前的研究                [18]
                                                                                          ®
              功能雄性个体的血浆皮质醇水平显著高于统治                                 原位杂交根据        RNAScope 多通道二代荧光
              地位个体，且非功能雄性个体下丘脑                     gr2  的表     试剂盒 (Advanced Cell Diagnostics, 美国) 说明书
              达显著高于功能雄性，提示社会压力引起的糖                             操作。首先是预处理，冷冻组织切片用                     1×PBS
              皮质激素水平变化可能通过脑部糖皮质激素受                             溶液清洗     5 min，双氧水孵育       10 min，置于缓慢
              体调节性腺发育等生殖功能 。RNAscope 技术                        沸腾 (98~102 ℃) 的   1×靶标修复剂中处理          5 min。
                                        [17]
              是一种新型的原位杂交检测方法，该技术具有高                            无水乙醇清洗载玻片，确保在室温下完全干燥，

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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