Page 43 - 《水产学报》2025年第7期

陈庆宇，等 水产学报, 2025, 49(7): 079104

随后使用低温离心机 7 500 r/min 离心 6 min，取 10 min)、二甲苯透明 (3 min)、石蜡包埋后，置
上清液制备成皮肤提取液 (浓度 5.5 mg/mL)，并 于组织切片机上切成 7 µm 的石蜡切片。干燥的
分装成 1 mL 置于−80 °C 备用 。 组织切片脱蜡 (二甲苯 10 min×3，梯度乙醇从
[19]

100% 到 50% 各 5 min) 后，进行 PAS 染色 (按
1.3 皮肤提取液下斑马鱼的惊恐反应行为测试
照上海源叶的说明书顺序，使用阿利新蓝染色
测试鱼缸 (30 cm×18 cm×20 cm，水深 12 cm) 8 min、过碘酸氧化 5 min、Schiff Reagent 侵染
底部划线分割成 3 cm×3 cm 的格子，鱼缸侧面 9 min、苏木素染核 30 s、酸性分化液分化 2 s
分为三等份水体，并用不透明白纸包围，避免 和 Scott 蓝化液返蓝 20 s)，梯度乙醇脱水 (50%
人为干扰。行为测试时，使用 25 mL 烧杯将单尾 乙醇到 95% 乙醇各 1 min，100% 乙醇 10 min)，
斑马鱼转移至鱼缸中适应 30 min 后，远距离 二甲苯透明 (5 min×2) 后，用中性树胶封片，并
(2 m) 通过 50 mL 注射针管连接加样管 (直径 置于光学显微镜 (徕卡，上海) 下观察拍照。
5 mm)，将冰上提前解冻的皮肤提取液 (1 mL，
1.5 皮肤提取液长期刺激处理及斑马鱼焦虑和
5.5 mg/mL，预冷超纯水稀释成 50 mL) 缓慢注
探索行为测试
射入鱼缸的气石处。通过鱼缸上方和侧面的摄
像头记录加样前后 5 min 斑马鱼的行为，包括： 根据上述实验结果，设置 3 个皮肤提取液
首次出现僵滞行为的时间 (s)、首次僵滞行为的 浓度梯度，即原液 (5.5 mg/mL)、10 倍和 50 倍
持续时间 (s)、僵滞行为的次数、僵滞行为的总 稀释，并将 1 mL 皮肤提取液添加到 27.0 L 水体
时间 (s)、突然加速游动的次数、鱼缸三分之一 中，进行为期 20 d 长期刺激。并每天向水体中
处累计时间 (垂直方向上靠近底部，s)、底部累 添加 4 次 (6:00、12:00、18:00 和 24:00) 以确保
计时间 (s)、缸壁处累计时间 (s) 和跨越格子的 水体中的持续有效作用，养殖过程同“实验对
次数。僵滞行为表现为斑马鱼在鱼缸中除了眼 象”。在处理第 0、10 和 20 天分别使用新水缸
睛和鳃盖动而身体僵直不动的状态；突然加速 潜水测试 [20-21] 和光暗测试 [21] 对斑马鱼焦虑行为
游动行为表现为斑马鱼短时间内多次变换方向 进 行 测 试 ， 并 使 用 新 物 体 测 试 (Novel object
且速度增大。 test) [22] 对斑马鱼探索行为进行测试。

新水缸潜水测试鱼缸如图 1-a 所示，通过
1.4 斑马鱼皮肤 PAS (Periodic Acid-Schiff stain)
画线将水体分为上下两等份。测试开始时，使
染色
用 50 mL 烧杯将单尾鱼轻轻转移至鱼缸中间部
解剖斑马鱼背鳍与头部之间、背中线两侧 位的不透明塑料圆筒中，适应 10 min 后，轻
的皮肤置于 4% 多聚甲醛固定液 (北京索莱宝科 轻移去圆筒，通过上方和侧方的摄像头记录
技有限公司，北京) 中固定。随后，皮肤组织经 6 min 内斑马鱼的行为，包括进入顶部区域的潜
梯 度 乙 醇 脱 水 (按 照 50% 乙 醇 、 70% 乙 醇 、 伏期 (s)、进入次数、累计时间 (s)、僵滞行为的
80% 乙 醇 、 95% 乙 醇 、 100% 乙 醇 ×2 顺 序 各 次数和持续时间 (s)。

20 cm
上`top
下`bottom 4 cm
18 cm 6 cm
30 cm
(a) (b) (c)
图 1 焦虑和探索行为测试装置
(a) 新水缸潜水测试装置；(b) 光暗测试装置；(c) 新物体测试装置。
Fig. 1 Anxiety-like and exploratory behavior test schematic diagrams
(a) schematic diagrams of the experimental procedures for the novel tank diving test; (b) schematic diagrams of the experimental procedures for the
light/dark test; (c) schematic diagrams of the experimental procedures for the novel object test.

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