Page 93 - 《水产学报》2025年第6期

张小明，等 水产学报, 2025, 49(6): 069108

体 生 长 发 育 。 在 长 牡 蛎 (Crassostrea gigas) 、 于 0、4、8、12 和 24 h 时采集样品，每次从集气
[9]
栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 、军曹鱼 (Rachycen- 瓶中取出 9 只。使用一次性无菌注射器在瘤背石
[10]
tron canadum) [11] 等水生动物中均有所报道。 磺腹部抽取 1 mL 血淋巴于离心管中，随后使用
瘤背石磺 (Onchidium reevesii) 是一种生活 无菌器械进解剖取肝胰腺于离心管中。所有样
在潮间带的两栖性海洋贝类，主要分布在我国 品立即放入液氮速冻后转至−80℃ 冰箱保存备用。
沿海的潮上带滩涂，其矿物质元素和脂溶性维 1.3 测定指标与方法
[12]
生素含量丰富，具有较高的药用和食用价值 。
生化指标的测定 取 0.1 g 肝胰腺组织加
瘤背石磺受潮汐的影响，极易受到低氧威胁。
入 1 mL 提取液，冰浴条件下机械匀浆，8 000×g
为了适应这种特殊的生存环境，瘤背石磺逐渐
4 ℃ 离心 10 min，取上清液置于冰上待测。取
进化出“肺囊”作为摄取氧气的器官 。实验室
[13]
500 μL血淋巴样品，1 800 r/min 4 ℃ 离心 10 min，
在前期的研究中发现，溶解氧含量为 (2.0 ± 0.2)
取上清液置于冰上待测。
mg/L 时低氧信号通路相关基因 (hif-1α 和 glut-1)、
总蛋白含量的测定根据 BCA 法微量蛋白
糖酵解相关基因 (hk 和 pk) 的表达均有不同程度
质浓度测定试剂盒说明书进行操作 [ 生工生物
的上调。但目前关于低氧胁迫对瘤背石磺生理
工程 (上海) 股份有限公司 ]，使用酶标仪 (Syn-
生化和免疫方面的研究相对匮乏。因此，本实
ergy 2，美国) 测定吸光度；血糖、肝糖原、乳
验以瘤背石磺为研究对象，开展低氧胁迫对瘤
背石磺血清和肝胰腺能量代谢、抗氧化和免疫 酸、过氧化氢酶 (CAT)、丙二醛 (MDA) 采用比
色法，根据试剂盒说明书进行操作 [ 生工生物
功能的研究，为探究低氧胁迫下潮间带动物的
工程 (上海) 股份有限公司 ]，使用分光光度计
生理和免疫机制提供参考。
测定吸光度；还原型谷胱甘肽 (GSH)、谷丙转
1 材料与方法 氨酶 (ALT)和谷草转氨酶 (AST)(南京建成生物
工程研究所) 采用酶标法，根据试剂盒说明书进
1.1 实验材料 行操作，通过酶标仪测定吸光度。

瘤背石磺采集于上海市崇明岛的潮上带滩 RNA 提 取 和 cDNA 合 成 采 用 TRI-
zol 法提取肝胰腺总 RNA。经琼脂糖凝胶电泳
涂。将采集到的瘤背石磺运回实验室后放置于
检测总 RNA 的质量，使用 NanoDrop 2000 检测
塑料箱(长 80 cm，宽 58 cm，高 45 cm) 中暂养
其浓度。选择 OD /OD 0 值为 1.8~2.0，凝胶
1 周。暂养期间，每天定期投喂并清理排泄物， 260 28
电泳条带单一、清晰的样本为模板，置于−80 ℃
喷洒适量海水保持箱体内湿度。实验过程中操
保存备用。使用 Primer Script RT 试剂盒合成
作人员严格遵守动物伦理规范，并按照相关规
cDNA，置于−20 ℃ 保存备用。
章制度执行。
实时荧光定量 PCR 在本实验室已有的
1.2 样品采集 瘤背石磺转录组数据库中获得糖原磷酸化酶
实验根据低氧胁迫时间设计 5 个组：0 (对 (GP)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 和热休克
照组)、4、8、12 和 24 h低氧胁迫组，每组 9 个 蛋白 70 (Hsp70) 基因序列，利用 Primer Premier
生物学重复。挑选健康活泼、大小均一的瘤背 5.0 软件设计引物 (表 1)。采用 SYBR premix Ex
石磺共 45 只 [ 体重 (14.65 ± 0.63) g]，随机放入
表 1 实验所用的引物序列
5 个大小相同的集气瓶 (2 L) 中。低氧胁迫组的
Tab. 1 Sequences of primers used in this study
水体溶解氧含量为 [(2.0±0.2) mg/L]。将 5 个集
引物名称 序列(5′-3′) 用途
气瓶中各装入 2/3 体积的海水，向水体中持续 primer name sequence(5′-3′) application
通入氮气，使用溶氧仪实时测定水体溶解氧含 β-actin F: GTCCACCGCAAGTGCTTCT 实时荧光定量
量。当溶解氧含量达 (2.0±0.2) mg/L 时停止通气， R: CGGTCGTGGTTGTTTCATT
GP F: GTTTGCTCTCTGTGCTGATTTC 实时荧光定量
立即将用干净纱布包裹的瘤背石磺放入集气瓶， R: GTTTGCTCTCTGTGCTGATTTC
用保鲜膜封住瓶口。在实验过程中间隔 1 h 使用 GSH-Px F: GTCGATCCTGTGACAATAGTTAGG 实时荧光定量
R: GTCTAGGTCTGCTGGTTTCATC
溶氧仪检测水体溶解氧含量，维持溶解氧含量
Hsp70 F: GTTACTACAGCTCACTCCCTTG 实时荧光定量
在 (2.0±0.2) mg/L 水平。在低氧胁迫过程中，分别 R: GGCGCTCAGCTAGAAAGAATA

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