Page 176 - 《水产学报》2025年第6期

梅静，等 水产学报, 2025, 49(6): 069615

范，并按照西南大学伦理委员会制定的规章制 的 20 只蚌平均放入 2 个只含有 10 L 曝气水的
度执行。 水族箱中。一个水族箱作为对照组继续保持水

温为 23 °C (T1-C、T2-C 和 T3-C)，另一个水族
1.2 养殖水体理化性质的测定
箱作为实验组进行 33 °C 的高温处理 (T1-E、T2-E
将风干后的 3 种紫色土 S1、S2、S3 (土粒
和 T3-E)，分别在 0、6 和 12 h 采集 3 种养殖系
直径 < 2 cm) 作为底泥，放置于 9 个水族箱中
统的对照组和实验组三角帆蚌，检测血淋巴抗
(圆柱体水族箱底面直径 50 cm、高 1.5 m，参
氧化酶活性和肝胰腺免疫相关基因的表达。

照 Nimrat 等 [23] 的方法，以土水体积比 1∶5 的
比例进行覆水，土层厚 20 cm，覆水 100 cm)， 1.4 血淋巴采集及酶活性指标的测定
以 3 种土壤底泥为对照设置 3 种养殖系统 (T1、 每个实验组和对照组取 3 只活体蚌，打开
T2、T3)，每种养殖系统设置 3 个平行。在每个 蚌壳，用预冷的 1 mL 注射器从心脏抽取血淋巴，
水族箱的水表层下 50 cm 处使用吊网吊养 50 只 于冰上放置 30 min 后 4 °C、3 500 r/min 离心 10
三角帆蚌，每天饲喂 2 次 (将三角帆蚌提出放 min，收集上清液，放入−80 °C 冰箱中保存备用。
入 5.6×10 个/mL 的小球藻液中浸泡 1 h)，养殖 血淋巴碱性磷酸酶 (AKP)、SOD、CAT、溶菌
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28 d，养殖过程中不间断充氧，温度控制在 酶 (LZM)活性和 H O 浓度均采用由上海优选生
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2
(23.0 ± 1.0) °C，每周换 1 次水，换水量约为 1/3。 物科技有限公司生产的商业试剂盒进行测定。

在 0、7、14、21 和 28 d 共 5 个时间点采集
1.5 RNA 的提取和 cDNA 的合成
水样并测定其理化性质。参考《水化学实验指
[24]
+
导》 ，氨氮 (NH -N) 含量的测定采用纳氏试 利用 TRIzol 法提取三角帆蚌肝胰腺的总
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剂光度法，亚硝态氮 (NO -N) 含量的测定采用 RNA，通过 0.1% 琼脂糖凝胶电泳测定总核糖
−
2
−
分子吸收分光光度法，硝态氮 (NO -N) 含量的 核酸的完整性，使用超微量分光光度计检测其
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®
测定采用紫外分光光度法，TN 含量的测定采用 浓 度 。 用 Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis
碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，TP 和活性 SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) [ 翌圣生
磷 (AP) 含量的测定采用钼酸铵紫外分光光度法， 物科技 (上海) 股份有限公司 ] 合成 cDNA。选
化学需氧量 (COD) 的测定采用碱性高锰酸钾法， 用基因延伸因子基因 (EF1α) 为内参基因，选取
总硬度 (TH) 的测定采用 EDTA 络合滴定法。 免疫相关基因凋亡抑制因子 (IAP)、白细胞介

素 17 (IL-17) 与热休克蛋白 70 (HSP70) 进行实
1.3 高温胁迫实验
时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 的测定 (表 1)。

在含有不同底泥的养殖系统中对三角帆蚌
1.6 数据分析
进行适应性养殖 28 d 后，将同种养殖系统 3 个
平行水族箱中的三角帆蚌混合，各选取 60 只进 以 2 −∆∆C t 法 [25] 计算基因相对表达量，用平
行高温胁迫实验。将每种养殖系统中选取的 60 均值±标准误 (mean ± SE) 表示。利用 GraphPad
只三角帆蚌分为 3 个平行组，再将每个平行组 Prism 9 软件对参数进行主成分分析 (PCA) 和图

表 1 RT-qPCR 所用引物序列
Tab. 1 Primer sequences used for RT-qPCR analysis
基因名称 引物序列(5′-3′) 引物长度/bp 退火温度/°C
gene ID primer sequences (5′-3′) primer length T m
EF1α-F GGAACTTTCCAGGCAGACTGTGC 23 59.84
EF1α-R TCAAAACGGGCCGCAGAAAT 21 60.05
IAP-F ATTCCATCCAACTGCCTCAAGA 22 56.14
IAP-R GTTTCTACTGCGGAGGTGGG 20 58.62
IL-17-F CCATCACAGATCCTCAACG 19 56.05
IL-17-R CGCAAGTGTATCCAACAGCAA 21 55.82
HSP70-F GGTGTGCCCCAGATTGAAGTA 21 60.00
HSP70-R TGACACGGTTCTCTGTTT 20 59.62

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