Page 141 - 《水产学报》2023年第1期

李晓晖，等 水产学报, 2023, 47(1): 019610

级结构。采用 MiRanda 软件和 qTar 软件进行 miR- 50 μL DMEM 培养基中，轻轻吹打混匀后再加入
17a-5p 的靶基因预测，取两个软件所得结果的交 1 μL Lipo6000 转染试剂，充分混匀后室温静置
集作为潜在靶基因。使用基迪奥云平台在线工具 20 min，将混合液均匀滴加到细胞培养板中，轻
(https://www.omicshare.com/tools/) 对获得的潜在靶 轻摇匀后放入培养箱，6 h 后更换培养基，继续培
基因进行 GO 功能和 KEGG 通路富集分析。 养 48 h。按照 Dual-Luciferase Reporter 测定体系，
®
1.3 miR-17a-5p 模拟物的合成 用 Synergy 2 多功能检测仪检测转染后的细胞的荧
光素酶活性。
基于高通量测序获得的鲢 miR-17a-5p 序列，
由湖州河马生物科技有限公司进行 miR-17a-5p 模 1.6 总 RNA 提取和 cDNA 的合成
拟物 (mimics) 的合成，mimics 具有双链结构，正 按照 Trizol (Invitrogen) 操作指南提取总 RNA。
义 链 (sense) 能 够 模 拟 miRNA 的 活 性 ， 反 义 链 利 用 超 微 量 分 光 光 度 计 (NP80， IMPLEN) 检 测
(antisense) 则不能，但可作为阴性对照，序列见表 1。 RNA 的 浓 度 ， 并 用 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测

1.4 双荧光素酶报告野生型与突变型基因载体 RNA 的完整性。miRNA 逆转录按照 MiRNA 1st
的构建 Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) 试剂盒说
明书操作，其中 miR17a-5p 茎环引物为 GTCGTAT
根据本课题组已获得的鲢基因组序列，由武
CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA
汉转导生物实验室有限公司设计合成 HIF-1α 的野
TACGACTACCTG，内参 U6 茎环引物为 AAAAC
生型 (WT) 与突变型 (MUT) 3′UTR 片段，片段包
AGCAATATGGAGCGC。mRNA 逆转录按照 HiS-
含 miR-17a-5p 与 HIF-1α 预测到的结合位点，其
cript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)
中突变型 3′UTR 片段中，miR-17a-5p 与 HIF-1α
试剂盒说明书操作，获得的 cDNA 保存于−20 °C
的结合位点设计为其互补序列。将两种 3′UTR 克
备用。
隆到 pmirGLO 双荧光素酶报告基因载体中，并测
序验证，构建 HIF-1α 野生型 (WT-pmirGLO-HIF- 1.7 荧光定量 PCR
1α 3′UTR) 和突变型 (MUT-pmirGLO-HIF-1α 3′UTR) 基于鲢 miR-17a-5p、U6、Ethe1、BPNT1 和 β-
双荧光素酶报告基因载体。 actin等基因序列设计引物 (表 2)，并由武汉天一辉
1.5 双荧光素酶活性检测实验 远生物科技有限公司进行引物的合成。以鲢肝脏、
脑、心脏和鳃组织的 cDNA 为模板，以 U6 和 β-
从武汉普诺赛 (Procell) 生命科技有限公司购
®
TM
actin 为内参，按照 ChamQ SYBR qPCR Master
买 293T 细胞系，用含有 10% 胎牛血清和 1% 的青
Mix 试剂说明书进行荧光定量 PCR。数据采用
霉素-链霉素的 DMEM 高糖培养基进行培养，待
2 −ΔΔC t 方法进行分析。
细胞密度高于 80% 时，将细胞传代至 24 孔板中
继续培养，确保每个孔的细胞密度达到约 70% 后 1.8 数据分析
进行转染。将 HIF-1α 野生型和突变型双荧光素 数据采用 Excel 2016 和 SPSS 25.0 软件进行统
酶表达载体与 miR-17a-5p 模拟物共转染至 293T 细 计分析，利用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)
胞。转染前更换新的细胞培养液，按照 Lipo6000 TM 和 Duncan 氏多重比较对数据进行差异分析，统计
转染试剂盒说明书进行转染，取 2 μg 双荧光素酶 值均为平均值±标准差 (mean±SD)，P<0.05 表示数
报告基因质粒加入到含有 8 μL miRNA mimics 的 据之间存在显著差异。

表 1 miR-17a-5P mimics 序列
Tab. 1 miR-17a-5P mimics sequence
名称 序列方向 引物序列(5′→3′)
name sequence direction primer sequence (5′→3′)
mimics miR-17a-5p 正义链 sense CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUA
mimics NC 反义链 antisense UACCUGCACUGUAAGCACUUUG

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