Page 58 - 《渔业研究》2025年第6期
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第 6 期               金楠霖等： 红尾皇冠鱼源彭氏变形杆菌的分离、鉴定及药敏实验                                      749

              尾增至    100  尾以上。本研究从该患病红尾皇冠鱼内                    最终将    PCR  扩增产物委托北京六合华大基因科
              脏分离鉴定病原菌，并通过人工感染和药敏实验，                           技有限公司进行基因序列测定。将测序结果输
              明确彭氏变形杆菌对红尾皇冠鱼的致病性及几种常                           入  NCBI 数据库，利用       Blast 工具进行同源性比
              用水产养殖药物的敏感性，旨在为其病害科学防控                           对分析，并筛选不同基因序列，构建系统发育进
              和养殖生产提供理论依据。                                     化树。
                                                                1.2.3 回归感染实验
               1 材料与方法
                                                                   选取实验室暂养的        100  尾健康红尾皇冠鱼，平
               1.1 实验材料                                        均分成   4  个实验组和     1  个空白对照组，每组        10 尾
                  患病红尾皇冠鱼来自辽宁省某观赏鱼养殖基                          鱼，设置     2  个平行（平行①  、 ②组） 。采用腹腔
              地，体质量为（50±5）g。实验所使用的健康红                          注射的方式，对        4  个实验组（实验组       1~实验组    4）
                                                                                            4
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              尾皇冠鱼购自辽宁省辽阳鲁家村观赏鱼养殖基地，                           的红尾皇冠鱼分别注射         100 μL 5×10 、5×10 、5×10 、
                                                                                                         6
              该养殖场养殖红尾皇冠鱼健康状况较好，鱼体质量                           5×10  CFU/mL  的菌液，空白对照组注射等体积的
                                                                   7
              平均为（50±5）g。为确保健康实验鱼无潜在病原                         生理盐水。整个实验周期为             7 d，期间持续观察鱼
              感染，避免干扰实验结果，实验前，所有健康红尾                           体发病症状，每日记录死亡数量。针对有明显发病
              皇冠鱼在购入后均进行为期             7 d 的隔离检疫。实验            症状的红尾皇冠鱼，立即进行解剖，从其体内分离
              期间通过充气泵为水体增氧，水温为                 23~25 ℃，日       病原细菌并鉴定，验证分离菌株与原始菌株的一致
              投喂饵    2  次，换水量为     1/3。彭氏变形杆菌菌株从               性。以分离菌株注射剂量对数值为                X  轴，实验鱼
              现场患病红尾皇冠鱼肝脏中分离纯化得到，保存菌                           死亡率为    Y  轴，建立关系曲线，用概率单位图解
              种于大连海洋大学水生动物医院实验室，用于后续                           法计算半致死剂量（Median lethal dose，LD ） 。
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              实验，并将其命名为          2PSF2101。大连海洋大学实               1.2.4 生理生化指标测定
              验动物伦理审查委员会审批同意动物实验，批准编                               对分离得到的菌株分别进行菌落形态观察、菌
              号为   DLOU20250012。                               体形态观察及革兰氏染色。依据分子鉴定结果，参
               1.2 实验方法                                        考文献   [9-12]  及《常见细菌系统鉴定手册》 ，运用细
               1.2.1 细菌分离及纯化                                   菌生化微量反应管，对目标菌株的特异性生理生化
                  选取患病红尾皇冠鱼，75%           酒精消毒后无菌解             反应指标开展检测鉴定，以此进一步验证分子鉴定
              剖，将病变组织划线接种于普通营养琼脂平板，28 ℃                        结果的准确性。
              培养   24 h，初步筛选优势菌落后连续划线分离纯                        1.2.5 药敏实验
              化，将纯化菌株接种于普通肉汤培养基，30 ℃、                              本研究选取环丙沙星、恩诺沙星等                13  种药敏
              200 r/min  摇床培养  10 h，保存菌种。                      纸片，按照临床和实验室标准协会（Clinical and
               1.2.2 16S rRNA  基因序列测定及系统发育树构建                  Laboratory Standards Institute，CLSI）实验标准 [13] ，
                  取  1 mL  菌液，12 000 r/min  离心  1 min，弃上       采用药敏纸片扩散法测定             2PSF2301  菌株对抗菌
              清液，用     100 μL  无菌蒸馏水重新悬浮。将悬浮液                  药物的敏感性。具体操作如下：取                  0.1 mL  分离
              煮沸   5 min，迅速置于冰浴中冷却          1 min，随后再次         菌培养液，均匀涂布于琼脂平板表面，在平板上
              以  12 000 r/min  离心  1 min，取上清液作为反应的             间隔适当距离放置药敏纸片，随后置于                    28 ℃  恒
              模板进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reac-               温培养箱中培养        12 h。培养结束后，测量各药敏
              tion，PCR）扩增操作。实验采用细菌通用引物                         纸片周围抑菌圈的直径，抑菌圈直径选取                  2  个实验
              （ 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492R：         组的平均值，依据说明书判定该菌株对不同抗菌药
                                                  [8]
              5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’  ）  ，对细             物的敏感程度。抑菌圈直径≥16 mm              为敏感；抑菌
              菌的   16S rRNA  基因进行特异性扩增。扩增产物                    圈直径   11~15 mm  为中介；抑菌圈直径≤10 mm           为
              经纯化处理后进行测序分析。PCR                 反应具体条           耐药。
              件：首先在      95 ℃  条件下，预变性      5 min；随后进入          2 结果与分析
              循环反应，每个循环包括            94 ℃  变性  1 min、55 ℃
              退 火  1  min、 72  ℃  延 伸  2  min， 共 计 进 行  30  个   2.1 分离菌及回归感染
              循环；循环结束后，在         72 ℃  条件下，再延伸      10 min。        从患病红尾皇冠鱼肝脏分离出一株细菌，编号
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