Page 132 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 张 璐等：斑点叉尾鮰WNK 基因的鉴定及其对鲇鱼肠道败血症的响应 673

300 尾斑点叉尾鮰进行腹腔注射攻毒，每尾注射 以 0.1 ℃/s 的升温速率升温至 95 ℃。以各基因的
0.1 mL；对照组 50 尾，每尾注射 0.1 mL 灭菌培养 非模板对照为阴性对照，每个实验组采用 3 个生物
基。攻毒完成后，将斑点叉尾鮰转移至养殖系统 学重复并设置 3 个平行样，以减少样品间的差异，
中。攻毒后，每 4 h 检查斑点叉尾鮰，分别采集有 最后使用 2 −ΔΔCT 方法计算相对基因表达的倍数变
明显发病症状（肛门红肿，乱游） 、濒临死亡的斑 化，P<0.05 表示差异显著 [31] 。

点叉尾鮰的肠道和肝脏，标记为易感（YG）组； 表 1 本研究使用的引物
每 24 h 采 集 的 易 感 组 样 品 （ 分 别 记 为 YG24、 Tab. 1 Primers used in this study
YG48、YG72） ，3 尾斑点叉尾鮰为 1 组，合并装 引物 序列（5’—3’ ）
入 1 个冻存管，每个时间点 3 个生物学重复。攻毒 Primers Sequences (5’—3’)
WNK1a-F CTGGTGCGGGAAGAAC
感染 7 d 后，采集存活斑点叉尾鮰的肠道和肝脏，
WNK1a-R ATGCGGTCAGCGAGTA
3 尾斑点叉尾鮰为 1 组，合并装入 1 个冻存管，标
WNK1b-F CTCCCACAACCTTCGG
记为抗性（KX）组，并分别做好时间记录；采集
WNK1b-R CGGCACGACTCACAGA
30 尾注射灭菌培养基的斑点叉尾鮰的组织样本作
WNK2-F GCACCCGAGGAAATAG
为对照组，3 尾斑点叉尾鮰为 1 组，合并装入 1 个 WNK2-R GCCTTGAAGCGGAGTA
冻存管。所采集样品均在做好标记后，即刻投入液 WNK3-F TCCAGCATCCCATTTC
氮中，随后转移至−80℃ 超低温冰箱中保存，直至 WNK3-R CACGGTGTCTTGTTGTTC
进行核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）提取。青 WNK4a-F GCCCACGCATACAGAC
岛农业大学海洋科学与工程学院批准动物实验，批 WNK4a-R GCTTGCTTGGCTCATT
准编号为 QAU20200703-1。 WNK4b-F AGACGGACGGCTACCT
WNK4b-R GGATACGGCGATGCTC
1.5 总 RNA 提取和互补脱氧核糖核酸（Com-
EF-1α-F GTTGAAATGGTTCCTGGCAA
plementary deoxyribonucleic acid，cDNA）合成
EF-1α-R TCAACACTCTTGATGACACCAAC
使用并按照 RNA 提取试剂盒 Trizol Reagent
®
（Invitrogen，USA）的使用说明书，分别对样品
2 结果与分析
进行总 RNA 提取。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳，对
RNA 的污染及降解状况展开检测。随后，使用 2.1 斑点叉尾鮰中 WNK 基因家族的鉴定
Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo electron north 从斑点叉尾鮰基因组中鉴定出 6 个 WNK 基
America LLC，FL） ，测定每个样品的 RNA 浓度 因 ， 分 别 为 WNK1a、 WNK1b、 WNK2、 WNK3、
与完整性，所有 RNA 样品的 A 0 比值均大于 WNK4a 和 WNK4b。 6 个 WNK 基 因 的 转 录 本 特
260/28
1.8。将通过检测的样品 RNA 稀释到 500 ng/µL， 征，包括转录本大小、编码蛋白的数量、其染色体
利用 All-in-one 5X RT MasterMix 试剂盒（ABM， 位置及其遗传结构域等，如表 2 和图 1 所示。使用
Canada）进行反转录，获得相应的 cDNA 的第一条 在线工具 WoLF PSORT 预测了亚细胞定位，发现

链，用于实时荧光定量聚合酶链式反应（Quanti- 斑点叉尾鮰的 6 个 WNK 蛋白位于细胞核中。
tative Real-time polymerase chain reaction，qPCR） 。 2.2 斑点叉尾鮰WNK 基因的系统发育分析
1.6 qPCR 检测 通过系统发育分析对斑点叉尾鮰WNK 基因
利用 Primer5 设计斑点叉尾鮰WNK 基因的 qPCR 进行注释，如图 2 所示。包括斑点叉尾鮰WNK
的引物，并以延伸因子 1α 基因（Elongation factor 基因在内的所有物种的 WNK 基因聚集成 A 组~
1α gene，EF-1α）作为内参基因（表 1） 。qPCR 反 D 组 4 个亚分支，斑点叉尾鮰的 WNK1a、WNK1b、
应体系包含 0.4 μL 正向/反向引物（10 μmol/L） 、 WNK2、WNK3、WNK4a 和 WNK4b 基因被置于它
5.0 μL SYBR Green 荧光染料预混液、3.2 μL 无 们相应的分支中，包含硬骨鱼、鸟类、两栖类和哺
RNase/DNase 的水以及 1.0 μL cDNA。然后，使用 乳动物的对应基因，表明在分析的脊椎动物中存在
qPCR 检测系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules， 同源关系。来自鸟类、两栖类和哺乳动物的对应基
CA）进行分析。反应混合液在 95 ℃ 下预变性 因率先聚为一支，然后与鱼类的对应基因聚为一
5 min，随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 ℃ 支。在进化关系上，斑点叉尾鮰的 6 个 WNK 基因
变性 5 s、60 ℃ 退火 30 s 和 72 ℃ 延伸 30 s，然后 都首先与来自长鳍真鮰和斑马鱼的对应基因聚为一