Page 131 - 《渔业研究》2025年第5期
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672                                  渔  业  研  究                                     第 47 卷

              体内通过Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，              白质资源库进行比对，进一步验证结果的准确性。
              T3SS）的效应物与靶宿主蛋白相互作用，破坏                           验证后的序列通过         BLASTN  对斑点叉尾鮰基因组
              宿主防御机制的激活          [14-15] ，并通过Ⅵ型分泌系统            数据库   [26]  进行反向检索验证，以验证         WNK  基因的
              （Type Ⅵ secretion system，T6SS）效应器     EvpP  的    拷贝数和序列准确性，截断            E  值为  1e 。MolQuest
                                                                                               −10
              易位显著抑制       NLRP3  炎性小体激活      [16] ，利用内体       软件中的     Fgenesh  算法 [27]  用于基因结构预测，从
              机制，从而使胞内吞噬体存活              [9-10] 。然而，目前杀        基因组支架中解析完整的基因。SMART                  数据库
              鱼爱德华氏菌侵入斑点叉尾鮰的内化过程及其涉及                           （http://smart.embl-heidelberg.de）和保守结构域数据
              的信号通路、基因和协调因子等方面仍不为人知。                           库  CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/
                  赖氨酸缺乏型蛋白激酶（With no lysine kinase，            wrpsb.cgi）用来鉴定     WNK   基因的特征结构域。
              WNK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可与三磷酸                          Phytozome 用于定位每个      WNK  基因在其染色体上
              腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）结合，参与              的物理位置，通过将基因组和基因位置文件导入                    TB-
              磷酸化作用，因其激酶亚结构域Ⅱ中缺乏其他激酶                           tools（ https://github.com/  CJ-Chen/TBtools/releases）
              具有的赖氨酸（K）残基而得名             [17-19] 。哺乳动物具有       来可视化基因家族成员的染色体位置，使用                  TBtools
              4  种  WNK  基因，分别为       WNK1、WNK2、WNK3           中 的 染 色 体 分 布 模 块 绘 制 基 因 位 置      [28] 。 使 用
              和  WNK4，其结构通常由         1 个  N-端结构域、1 个高          TBtools 进行基因结构分析，预测每个             WNK   基因
              度保守的激酶催化结构域及              1  个  C-端自抑制结构         的外显子和内含子的位置和数量               [29] 。通过  WoLF
              域构成   [20] 。WNK  基因主要在参与上皮细胞膜上离                  PSORT（https://psort.hgc.jp/）预测  WNK  蛋白的亚
              子运输过程、维持细胞的渗透压和保持细胞体                             细胞定位。
              积的平衡中发挥重要作用             [21-23] 。一项研究揭示了          1.2 系统发育分析
              WNK1  调控巨噬细胞中的         NLRP3  炎性小体的激活                使用来自人类、小鼠、红原鸡（Gallus gallus） 、
              和细胞焦亡，通过感知巨噬细胞内较低的氯离子                            非洲爪蟾（Xenopus tropicalis） 、斑马鱼、海水青
              （Cl ）水平，其可通过激活阳离子-Cl 协同转运蛋                       鳉（Oryzias melastigma） 、红鳍东方鲀（Takifugu
                                                –
                  –
                                           +
                                                     –
              白来平衡细胞内的离子水平（Na 、K 和             +   Cl ） ，从     rubripes） 、斑点叉尾鮰和长鳍真鮰（Ictalurus furca-
              而抑制    NLRP3  炎性小体激活      [24] 。但是  WNK  基因      tus）的  WNK  基因，利用进化树分析软件          MEGA6 [30] ，
              家族在鱼类中的免疫机制尚未得到深入探究。                             采用最大似然法（Maximum likelihood，ML） ，对
                  WNK1  与  NLRP3  炎性小体之间复杂的相互作                 WNK  基因进行系统发育分析。为确保结果的准确
              用关系可能是影响杀鱼爱德华氏菌在斑点叉尾鮰体                           性 ， 通 过  1 000  次 自 举 （ Bootstrap） 重 复 计 算 。
              内感染进程、决定宿主抗病能力的关键因素之一。                            1.3 斑点叉尾鮰WNK        基因的基因结构和保守基
              因此，为了解       WNK   基因在   ESC  发病机制中的作            序分析
              用，本研究通过生物信息学方式，鉴定                  WNK  基因           通过  TBtools 软件基于斑点叉尾鮰基因特征格
              家族并确定它们在         ESC  不同抗病群体中的表达差                式（GFF）文件构建斑点叉尾鮰WNK                基因家族每
              异，旨在为斑点叉尾鮰抗病分子选育提供支持。                            个成员的基因结构图。此外，提取               WNK   基因的蛋
                                                               白质序列，并使用         MEME  在线工具预测和分析保
               1 材料与方法
                                                               守基序。最大模数设置为            10，其他参数设置为默
               1.1 序列分析与鉴定                                     认值。获得所得基序信息，包括序列标识和共有序
                  为鉴定斑点叉尾鮰的          WNK  基因，从开放型数             列。MEME    结果通过     TBtools 进行可视化    [29] 。
              据库   NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和  ZFIN    1.4 实验动物处理与样品收集
              （http://zfin.org/）中检索下载人（Homo sapiens） 、             斑点叉尾鮰来源于山东枣庄伊运水产养殖有限
              小鼠（Mus musculus）和斑马鱼（Danio rerio）的               公司，平均体质量为          12.3 g，平均体长为     12.5 cm，
              WNK  基因的氨基酸序列。通过             TBLASTN  来比对        实验开始前在循环水系统中暂养至少两周（pH                     为
                                                        −5
              斑点叉尾鮰转录组数据库             [9,25] ，截断  E  值为  1e 。  7.3，12 h  光/暗循环，溶解氧含量为           8.26 mg/L） 。
              从数据库中鉴定出的候选序列运用                 ORF Finder 工     实验开始时，采用         1  倍半数致死量（Median lethal
                                                                                        7
              具 （ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 识  dose，LD ） （浓度为     6×10  CFU/mL） 、实验室
                                                                       50
              别序列的编码区，并通过            BLASTP  程序与   NCBI 蛋      保存的经生化鉴定确认过的杀鱼爱德华氏菌对
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