Page 121 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 李嘉洁，等：基于环境 DNA 宏条形码技术的珠江流域外来鱼类监测与入侵风险评估 50 卷
110°0′0″ 111°0′0″ 112°0′0″ 113°0′0″ 114°0′0″ 115°0′0″ 116°0′0″ E

N
26°0′0″ 西江 XJ N
N 北江 BJ
NX 东江 DJ
25°0′0″
SG
25°0′0″
! YZ
YD LC
! 24°0′0″
FLX ! HY
24°0′0″ !
DT
WX FK
GP TX !
! SL ! HZ 23°0′0″
DQ ZQ !
GG
23°0′0″ FS
JM
南海
the South China Sea 22°0′0″
0 15 30 60 90 120 km
22°0′0″
110°0′0″ 111°0′0″ 112°0′0″ 113°0′0″ 114°0′0″ 115°0′0″ E
图 1 珠江流域 3 个江段采样点分布情况
Fig. 1 Distribution of sampling points in three river sections of the Pearl River Basin
2 h 内完成水样过滤工作，用 0.45 μm 的硝酸纤维 合格的文库进行扩增子双端 250 bp 测序。
素膜对水样进行抽滤以富集 eDNA。抽滤时，弃
1.3 数据分析
去第 1 张滤膜，每桶水样过滤 eDNA 滤膜共 12
份 (500 mL/份)，滤膜置于冻存管，低温保存于 高通量测序 高通量测序下机的数据使用
−80 ℃ 冰箱中。根据试剂盒 DNeasy PowerSoil Kit vsearch v2.15 中的 fastp_mergepairs、fastx_filter 和
(QIAGEN，德国) 使用说明书提取滤膜上的 eDNA， derep_fulllength 子命令分别对序列进行双端合并、
[14]
经紫外分光光度计检测 DNA 浓度和质量后，所有 质控和去重复 。采用 USEARCH v10.0 的-unoise
[15]
样品于−20 ℃ 冷冻保存，待后续 PCR 扩增使用。 命令将非冗余序列去噪为扩增序列变体 (ASVs) 。
本实验选择鱼类线粒体 12S rDNA 通用宏条 使用 vsearch 的 usearch_global 命令生成特征表。
ASVs 采用课题组自建的鱼类 eDNA 宏条形码参考
形 码 扩 增 引 物 ： MiFish (F： GTYGGTAAAW-
数据库并使用 Qiime2-consensus-vsearch-tophits 算
CTCGTGCCAGC，R：CATAGTGGGGTATCTAAT-
CCYAGTTTG) 进 行 PCR 扩 增 。 PCR 反 应 体 系 法进行物种比对、注释，手动剔除无法鉴定到种
[14]
(25.00 μL)：超纯水 8.75 μL，正反向 12S rDNA 通 的鱼类信息，构建 ASV 物种丰度表 。
用宏条形码引物各 1.00 μL，模板 DNA 2.00 μL， 外来鱼类群落多样性 本研究主要从时间

dNTP (2.5 mmol/L) 2.00 μL，Q5 高保真 DNA 聚合 尺度 (丰水期、枯水期) 和空间尺度 (西江、东江、
酶 0.25 μL， 5×Reaction Buffer 和 5×GC Buffer 各 北江) 对珠江流域外来鱼类群落结构和多样性进行
5.00 μL。PCR反应条件：98 ℃ 预变性 2 min；98 ℃ 探究。在进行数据可视化前，对所有样本数据进
变 性 15 s， 55 ℃ 退 火 30 s， 72 ℃ 延 伸 30 s， 行抽平处理 (阈值设置为 8 000) 来排除不同样本测
25~30 个 循 环 ； 72 ℃ 终 延 伸 5 min， 保 存 温 度 序数据量之间的差异影响。基于抽平数据对珠江
10 ℃。PCR 产物用 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳检测， 流域外来鱼类进行 Alpha 多样性分析，包括 Shan-
设置空白对照和阴性对照，实验成功后利用 Axy- non 指数、Pielou 指数、Simpson 指数、Chao1 指
gen 凝胶回收试剂盒进行胶回收并纯化 PCR 产物。 数。为减少双零和高丰度物种数据的影响，在对
使用 Illumina 的 TruSeq Nano DNA LT 文库制备试 群落结构进行 PCoA 分析前对数据进行 Hellinger
剂盒进行文库构建，并在 NovaSeq-6000 平台上对 转化，使用“vegan”与“ggplot”包，基于“Bray-curtis”

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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