Page 57 - 《水产学报》2026年第01期
P. 57

1 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

              干扰链    1  组、干扰链     2  组)，每组雌雄各       10  只。     ku，等电点为     6.45，脂溶指数为       90.36，平均亲水
              干扰链    1  组和干扰链    2  组每只分别注射      10 ng  的干     系数为−0.099，推测其为亲水蛋白。根据氨基酸
              扰链，对照组每只注射同体积的               RNase-free water。   序列信息，发现梨形环棱螺             Cyp17a1  基因具有明
              注射部位为斧足后。分别在注射               12、24 h  后取样，       显 的 细 胞 色 素   P450  家 族 特 征 ， 下 划 线 部 分 为
              一份用于检测        Cyp17a1  基因的相对表达量，另          1     Cyp17a1  基因的亚铁血红素保守区，第              6  位具有
              份用于检测性腺中激素含量。与对照组相比计算                            保守的精氨酸，第         8  位有保守的半胱氨酸，是细
              出干扰率，筛选出干扰效果好的干扰链。                               胞色素   P450  家族基因发挥血红素活性所必须的结
                    睾酮、雌二醇含量的检测  将干扰过后                         构  (图  1)。将梨形环棱螺      Cyp17a1  在  NCBI 中与其
              的性腺组织与生理盐水混匀，组织匀浆后                    4 ℃  离     他物种进行序列比对，发现重合度较高，说明梨
                                                               形环棱螺    Cyp17a1  基因较为保守      (图  2)。进化树分
              心，3 000 r/min，10 min。取上清液，用酶联免疫
                                                               析结果显示，梨形环棱螺            Cyp17a1  基因与福寿螺
              试剂盒    (合肥莱尔生物科技有限公司) 检测梨形环
                                                               (Pomacea canaliculata) 的同源性较高，为      55.17%，
              棱螺性腺组织的睾酮和雌二醇含量。
                                                               与黑唇鲍     (Haliotis rubra) 的同源性为  46.84%，与
               1.7    17β-雌二醇和   17α-甲基睾酮浸泡梨形环                 红鲍  (H. rufescens) 的同源性为   45.88%。系统进化
              棱螺                                               树结果显示，梨形环棱螺与福寿螺的亲缘关系较
                   选择同一性腺发育时期，湿重为               (5±1) g  的梨    近，与福寿螺明显聚为一支，与智人                  (Homo sapi-
              形环棱螺。一共         300  只，分为   3  组  (空白对照组、        ens) 和斑马鱼相距较远       (图  3)，表明梨形环棱螺与
              17β-雌二醇组和      17α-甲基睾酮组)，每组          100  只，    无脊椎动物同源性较近。
              暴露   24 d。暂养时保持水温在          (25±1) ℃。每天固          2.2    梨形环棱螺   Cyp17a1  基因在各组织中的定
              定时间换水，喂食小球藻             (Chlorella) 液并添加等        量表达
              量的新鲜激素。17β-雌二醇            (E2) 和  17α-甲基睾酮
                                                                   取梨形环棱螺雌雄各组织              (性腺、外套膜、
              (MT) 均购自上海迈瑞尔生化科技有限公司，设置
                                                               足、鳃、肝脏)，按照“荧光定量”部分中的方法检
              2  个浓度组    (40  和  200 ng/L)。在暴露   0、6、12、
                                                               测  Cyp17a1  基因在雌雄各组织中的相对表达量。
              18  和  24 d  时取样保存于−80 ℃，用于提取         RNA。
                                                               通过  IBM SPSS Statistics 23  软件进行显著性分析。
               1.8    数据分析                                     结果显示，除鳃组织外，Cyp17a1             基因在雄性各

                   文中“基因序列验证与生物信息学分析”部分                        组织中的表达量均显著高于雌性各组织                  (图  4)。
              采用软件     DNAMAN 6.0   对氨基酸序列进行分析；                 2.3    Cyp17a1  在梨形环棱螺雌雄性腺中的定位
              MEGA 11.0  软件构建系统进化树；BioEdit 软件进
                                                                   按照“原位杂交”中的方法进行原位杂交实验，
              行 多 重 序 列 比 对 ； 在 线 网 站      ProtParam  (https://
                                                               结果显示，Cyp17a1      基因在卵巢滤泡壁、卵母细
              www.expasy.org/resources/protparam) 进行蛋白质的
                                                               胞和卵原细胞以及精巢精母细胞、精细胞中均观
              理化性质预测。“荧光定量”、“RNA                 干扰”以及
                                                               察到明显的蓝紫色杂交信号             (图版)。
              “17β-雌二醇和     17α-甲基睾酮浸泡梨形环棱螺”部
              分的数据均使用        SPSS 23.0  软件进行显著性分析，              2.4    RNA  干扰
              样本之间采用独立样本            t 检验和单因素方差分析，                  取处于同一性腺发育时期的梨形环棱螺，按
              数据绘制为均值±标准差的方式；使用软件                     Prism    照“RNA  干扰”中方法合成        2  条干扰链，雌螺和雄
              8  对数据进行分析和处理。                                   螺各干扰     12  和  24 h。qRT-PCR  法检测精巢和卵
                                                               巢 中  Cyp17a1  基 因 的 相 对 表 达 量 。 结 果 显 示 ，
               2    结果                                         在卵巢中，干扰链          1  组干扰  12 h  时，干扰率达

                                                               29.83%；干扰    24 h  时，干扰率达      34.28%。干扰
               2.1    梨形环棱螺   Cyp17a1  基因的序列分析
                                                               链  2  组干扰  12 h  时，干扰率达    69.39%；干扰    24 h
                   本实验克隆得到梨形环棱螺             Cyp17a1  基因开       时，干扰率达       43.91% (图  5-a)。在精巢中，干扰
              放阅读框     (ORF) 为  1 572 bp (登录号：PQ350012)，       链  1  组干扰  12 h  时，干扰率达    25.41%；干扰    24 h
              编码氨基酸      523  个  (图  1)。预测分子质量为       59.31    时，干扰率达       30%。干扰链     2  组干扰  12 h  时，干

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            4
   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62