Page 56 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 缪煜琳，等：梨形环棱螺 Cyp17a1 基因的表达及功能 50 卷

表 1 实验用到的引物名称和序列
Tab. 1 Primer names and sequences used in the study
引物名称 引物序列 (5'—3') 用途
primer name primer sequence (5'−3') purpose
Cyp17a1-1F TCGGAAGCAGAATATCAGTC 序列验证
Cyp17a1-1R GTGGTGTTTATGTTATAGTCCG sequence verification
qCyp17a1-F TGAGTTCGGCAAGATAGTGG 荧光定量
qCyp17a1-R TGCCATGTCACGGATGT real-time quantitative

NC-F CAACTATGCGGCTGCTTACT 内参基因引物
NC-R CCAGGCTGTCCCTCTTCAT reference gene primer
Cyp17a1-3F TAATACGACTCACTATAGGGTGAGTTCGGCAAGATAGTGG 原位杂交引物
Cyp17a1-3R TAATACGACTCACTATAGGGTGCCATGTCACGGATGT ISH primer
RNAi-F1 TTACTACCTTGCAGGACACC RNA干扰引物1
RNAi-R1 CCAGTTTGCCATCACTATCA RNAi primer 1
RNAi-F1+T7 TAATACGACTCACTATAGGGTTACTACCTTGCAGGACACC RNA干扰引物1+T7
RNAi-R1+T7 TAATACGACTCACTATAGGGCCAGTTTGCCATCACTATCA RNAi primer 1+T7
RNAi-F2 CGGCAAGATAGTGGGCAATG RNA干扰引物2
RNAi-R2 TCTGGGTGTCCTGCAAGGTA RNAi primer 2
RNAi-F2+T7 TAATACGACTCACTATAGGGCGGCAAGATAGTGGGCAATG RNA干扰引物2+T7
RNAi-R2+T7 TAATACGACTCACTATAGGGTCTGGGTGTCCTGCAAGGTA RNAi primer 2+T7

为模板，重复实验 3 次。用 CFX96 仪 (Bio Rad， 1.6 RNA 干扰
美国) 测量 Cyp17a1 基因的相对表达量。设计反应
干扰链的合成 分别在 Cyp17a1 基因的
总体系：2×TB Green Premix Ex Taq 10 μL (TaKaRa，
ORF 区设计引物，上游引物和下游引物之前加上
北京)，qCyp17a1-F(定量上游引物) 和 qCyp17a1-R
T7 启动子序列 (TAATACGACTCACTATAGGG)。
(定量下游引物) 各 0.8 μL，模板 cDNA 1.6 μL，无
将设计的 2 对引物进行交叉组合获得 4 对引物
酶水 6.8 μL。反应程序： 95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，
(表 1)。以梨形环棱螺成熟性腺 cDNA 为模板进
退火温度 60 ℃ 30 s，重复 40 个循环。
行 PCR 扩增，纯化回收产物。用 T7 High Efficiency
1.5 原位杂交 Transcription 试剂盒 (北京全式金生物技术股份有

原位杂交引物设计使用 Primer Premier 5.0 软 限公司) 进行逆转录。反应总体系 (20 μL)：5×T7
件。分别在设计的原位杂交引物的 5'端加上 T7 启 Transcription Reaction Buffer (4 μL)， NTP Mix
动子 (TAATACGACTCACTATAGGG)，与荧光定 (100 mmol/L)，T7 Transcription Enzyme Mix (2 μL)，
量引物交叉组成原位杂交的正义探针和反义探针 RNase Free Water (补足至 20 μL)，cDNA (500 ng)。
(表 1)。其中，空白组用正义探针标记，实验组用 37 ℃ 反应 2 h 后冰上混匀，再于 70 ℃ 反应 10 min。
反义探针标记。取梨形环棱螺的雌雄性腺 cDNA 反应结束静置 20 min 后，加入 RNase A 和 DNase
进行 PCR 扩增，割胶回收后体外转录并纯化。用 I 各 2 μL。此步骤为去除 ssRNA 和残留的 cDNA。
DIG RNA Labeling Mix 标记探针 (Roche，德国) 后 37 ℃ PCR 中反应 0.5 h 形成 dsRNA。加入醋酸钠
于–80 ℃ 储存。另采集 1 份梨形环棱螺雌雄性腺 和异丙醇，静置结束后在 4 ℃ 下 12 000 r/min 离
组织，在 4% 多聚甲醛溶液中浸泡 2 h，保存至 心 10 min，进行产物纯化。离心结束后弃上清液
70% 乙醇溶液。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸 并洗涤沉淀，重复 2 次，弃上清液直至风干管壁
蜡，包埋，切片后在烘箱中过夜。切片经过二甲 液体。用无酶水溶解沉淀，沉淀为形成的 dsRNA
苯脱蜡后，原位杂交步骤按照 Enhanced Sensitive 干扰链。检测其浓度后保存于−80 ℃。
ISH Detection kit Ⅱ试剂盒 (BOSTER，美国) 说明 干扰链的筛选 取处于同一性腺发育时期
书进行，于显微镜下观察蓝紫色杂交信号并拍照。 的梨形环棱螺雌雄各 30 只，分成 3 组 (对照组、

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