Page 55 - 《水产学报》2026年第01期
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1 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

              境中有雌螺数量大于雄螺的现象 ，在螺的养殖                            Cyp17a1  在梨形环棱螺性类固醇激素合成过程中
                                            [2]
              过程中，性别比例直接影响着生产繁殖效率。若                            的关键作用，为研究梨形环棱螺的性腺发育和性
              雄螺比例适当提高，可确保每只雌螺充分受精，                            激素合成提供理论依据。
              减少因雄性不足导致的繁殖瓶颈，从而提高群体
              繁殖效率。为了进一步研究梨形环棱螺的性别分                             1    材料与方法
              化机制，培育口感更佳，养殖成本更低，经济效
              益更高的的雄螺，进一步提高螺的繁殖效率，本                             1.1    实验材料
              实验针对梨形环棱螺性类固醇激素合成相关基因                                实验所用梨形环棱螺均来自上海海洋大学河
              Cyp17a1，从控制梨形环棱螺体内性激素合成、指                        道采捞，在实验室暂养            3 d  后，称量湿重为        3~
              导性别调控的角度展开研究，为梨形环棱螺性腺                            5 g，且健康的雌螺和雄螺           (雌螺∶雄螺=1∶1) 用
              发育与性别调控提供理论依据。                                   于实验。实验室内螺暂养水温为               (25±1) ℃。分别
                   性类固醇激素是由动物性腺等组织分泌合成                         对雌雄个体各组织        (性腺、外套膜、足、鳃、肝脏)
              的，在动物性别决定与维持方面都发挥着重要作                            进行采集，立刻放入液氮暂存，采集完后立刻放
              用 [3-5] 。其中，Cyp17a1  是细胞色素     P450  酶超家族        入−80 ℃  冰箱保存。另取一份雌雄性腺样本用                 4%
              的成员，而细胞色素          P450  酶既有  17α-羟化酶活性，         多聚甲醛固定       2 h 后，转移至     70%  乙醇溶液中保
                                    [6]
              又有   17, 20-裂解酶活性 ，参与着性类固醇激素                     存备用。本研究获得了上海海洋大学科学技术处
                          [7]
              的合成过程 。目前，在硬骨鱼中仅发现                       2  种    实验动物管理和使用伦理委员会批准                   (审批号：
              Cyp17a  基因亚型，即      Cyp17a1  和  Cyp17a2，它们       SHOU-DW-2024-056)，实验过程中操作人员严格
              的酶催化活性在鱼类中具有差异 。在斑马鱼                             遵守上海海洋大学科学技术处实验动物管理和使
                                              [8]
                                                               用伦理委员会伦理规范，并按照上海海洋大学科
              (Danio rerio) 中发现，Cyp17a1   的缺陷会导致斑马
                                                               学技术处伦理委员会制定的规章制度执行。
              鱼第二性征受到损害，使得精巢肥大，精子数量
              增加，且     Cyp17a1  缺陷鱼的全雄表型可以通过睾                   1.2    总  RNA  提取和  cDNA  合成
              酮 或 雌 二 醇 治 疗 恢 复 。 在 尼 罗 罗 非 鱼        (Oreo-        利用   TRIzol 法提取样本总       RNA，NanoDrop
                                   [9]
              chromis niloticus) 中，Cyp17a1  基因突变会导致雌               分度计    (ThermoFisher，美国) 以及        琼脂
                                                               2000                                1%
              鱼向雄鱼发生性逆转，使得鱼体内的睾酮和雌二                            糖凝胶电泳进行核酸检测。为避免反复冻融降低
              醇的产生发生显著下降 。在半滑舌鳎                   (Cynoglos-   RNA  质量，迅速对       RNA  进行反转录得到        cDNA
                                   [10]
              sus semilaevis) 中发现，Cyp17a1  会调控其体内性             模 板  (Primer  Script  TMRT  reagent  Kit  with  gDNA
              类 固 醇 激 素 的 生 成    [11] 。 在 三 角 帆 蚌  (Hyriopsis  Eraser，TaKaRa，日本)，放入      40 ℃  冰箱暂存备用。
              cumingii) 中，雌二醇和甲基睾酮可以直接影响性
                                                                1.3    基因序列验证与生物信息学分析
              激素合成的信号通路，影响              Cyp17a  基因的活性，
                                                                   在 梨 形 环 棱 螺 基 因 组 数 据 库 中 获 取 部 分
              干扰性类固醇激素的合成过程，从而参与蚌体内
                                                               Cyp17a1  序 列 ， 与  NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.
              性腺发育和性别分化过程             [12] 。Cyp17a1  基因已在
                                                               gov/) 上其他物种的     Cyp17a1  基因序列进行比对确
              多种水产动物中被鉴定，如绿鳍马面鲀                      (Tham-
                                                               认。通过     Primer Premier 5.0  软件设计序列验证引
              naconus  modestus)、 三 角 帆 蚌 、 虾 夷 马 粪 海 胆
                                                               物  (表  1) 进行  PCR  扩增，割胶回收，连接转化。
              (Strongylocentrotus intermedius)、许氏平鲉  (Sebastes
                                                               涂板培养     12 h，挑选连接成功的白色菌落送至生
              schlegelii)、条斑星鲽   (Verasper moseri) 等 [13-16] 。
                                                               工生物工程      (上海) 股份有限公司测序。验证已知
                   本实验首次在梨形环棱螺中对              Cyp17a1  基因
                                                               基因序列的准确性。
              进行了克隆并获得了           cDNA  序列。通过实时荧光
                                                                1.4    荧光定量
              定量   (qRT-PCR) 和原位杂交     (ISH) 检测了   Cyp17a1
              在梨形环棱螺不同组织中的表达差异及在性腺中                                用  Primer  Premier  5.0  软 件 在  Cyp17a1  基 因
              的表达位置，RNA         干扰   (RNAi) 后检测了梨形环            ORF  区设计引物     (表  1)。雌雄各组织之间以         RPL5
              棱螺体内性类固醇激素的表达量变化。并通过外                            作为内参基因      (表  1)。取成熟期梨形环棱螺雌雄不
              源激素浸泡检测          Cyp17a1  的表达量变化，探究              同组织   (性腺、外套膜、足、鳃、肝脏) 的               cDNA

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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