Page 28 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 水 产 学 报 50 卷

敲除纯合突变体，命名为 pcolcea －/ － ; pcolceb －/ － 。 48 h，随后在平生医疗科技 (昆山) 有限公司的
1.5 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成 Nemo Micro-CT (NMC-200) 设备上进行 Micro-CT
扫描分析，以 12 μm 的体素大小 (使用 90 kV 的 X
选择野生型斑马鱼骨骼形成的三个关键时期
射线管电位，65 μA 的 X 射线强度) 扫描斑马鱼样
(20 dpf 和 30 dpf 是骨骼快速发育的时期，45 dpf
本。野生型和 3 种突变体斑马鱼各 3 尾，共 12 尾。
和 60 pdf 是骨骼单元逐渐完全显现的时期，90
使用小鼠胫骨的标准骨密度模型 (QRM-MircoCT-
dpf 是斑马鱼性成熟且骨骼形态稳定的时期) 的尾
HA，德国) 校准后，对斑马鱼的脊椎和肋骨进行
部肌肉 (含肌间刺) 样品以分析 pcolcea 和 pcol-
组织矿物质密度测量。
ceb 的表达情况。选择 5 月龄野生型及突变体斑马
鱼尾部椎骨样品，对 2 个 pcolce 下游调控基因 1.7 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)
(bmp1a、bmp1b)，3 个胶原蛋白发育基因 (col1a1a、 使用 NCBI 网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
col1a1b、 col1a2) 和 5 个 骨 骼 发 育 基 因 (runx2b、
tools/primer-blast/) 设计定量引物，由擎科生物科
entpd5a、alpl、bglap、sp7) 进行表达分析。
技股份有限公司合成 (表 3)。使用 Prime Script
按照 NAiso Plus Reagent (TaKaRa，大连) 说
RT Reagent Kit with g DNA Eraser (No. RR047A，
明 书 提 取 总 RNA。 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测
TaKaRa) 合 成 cDNA。 根 据 试 剂 盒 Hieff qPCR
®
RNA 质量和完整性，使用 K5600 超微量分光光度
SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus，翌圣) 说
®
计 (KRiRo，北京) 检测 RNA 浓度和 OD 值。使用
明配制 PCR 体系，β-actin 作为内参，在 QuantStu-
HiScript ІІ Q RT Super Mix for qPCR (+ gDNA wiper)
dio 6 Flex 实 时 PCR 系 统 (Applied Biosystems，
试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA，稀释 5 倍后于
ABI，美国) 上进行 RT-qPCR 分析。所有实验均
−20℃ 保存。
设 置 3 个 重 复 ， 使 用 2 −∆∆C t 法 计 算 目 的 基 因 的
1.6 显微型计算机断层扫描分析 (Micro-CT)
mRNA 相对表达量，并通过 IBM SPSS Statistics
将 5 月龄斑马鱼保存在 4% 的多聚甲醛中 (version 22.0) 软件的 Turkey 氏多重比较法和 t 检

表 3 实时荧光定量 PCR 引物序列
Tab. 3 Sequences of the primers used for RT-qPCR
引物名称 序列 (5′—3′) 退火温度/℃ 产物片段/ bp
primer primer sequence (5′—3′) annealing temperature product size
pcolcea F: CCTATAAGACTGGCAGACTC 60 221
R:TGGCTGGTTGTTGATGTT
pcolceb F: GCCATTAGACCTCAACCAA 60 172
R: CCATCGTGCCTATTCTCTT
bmp1a F: TCGATCTGGACGCGATTGAG 60 122
R: TTCCTCATCCAGCGCAATGT
bmp1b F: CGTGACGGATACGGGAGAAG 60 175
R: GTCTCACTTCGCCTCCACAA
col1a1a F: TCATGAGAGAAGCACACCTTAG 60 178
R: CAAGTCCATTGGGCAGTCAG
col1a1b F: AGGGAGTTTCTGCTAGGGTCT 60 179
R: TCTCACTGCAAGGACCACTG
col1a2 F: TGTCAAAACATGAAATGGGTTTTCT 60 190
R: AGCATCCCAAGTTGCAGTGA
runx2b F: CACTTACCACAGAGCCATT 60 110
R: TGAGACGGTCAGAGAACA
entpd5a F: GGCAGAGGCAACATATTAC 60 245
R: CATTGTCAAGCACTGGAAG
alpl F: ACGCAGGCTGATAGATAAC 60 184
R: GGCAATGTTCTTGTTGAGTT
bglap F: ATGAAGGTGTGTTTGTGAAG 60 172
R: TAGGCGGTGATGATTCCA
sp7 F: TCCGTATCCATCCGTAGG 60 193
R: GCAATCGCAAGAAGACCT
β-actin F: GGCATCACACCTTCTACAA 60 208
R: GAGTCCATCACAATACCAGTA

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