Page 26 - 《水产学报》2026年第01期
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1 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

              前胶原    C  前肽，是合成脊椎动物细胞外基质主要                      均由中国科学院水生生物研究所提供，后代在华
              纤维成分的必要步骤 。前胶原                C  前肽由骨形态          中农业大学水产学院繁殖饲养，水温保持在                    28℃，
                                  [4]
              发生蛋白      1 (bone morphogenetic protein 1，BMP1)  光暗交替周期为        14 h  光照和  10 h  黑暗。斑马鱼胚
              和相关金属蛋白酶所提供的                pCPs 活性切割    [5-6] 。  胎在  28℃  下培养，5~14 dpf 饲喂草履虫，14 dpf

              PCOLCE  是 通 过 其   CUB  结 构 域 与 前 胶 原    III 的    后饲喂丰年虫。实验采集了以下组织样品：20                     尾
              C-前体肽以及通过其         NTR  结构域与肝素硫酸酯结               20 dpf 野生型斑马鱼的尾部肌肉，30、45、60               及
              合，来增强      BMP-1  的活性，促进胶原前体的成熟，                 90 dpf 野生型鱼 (各   9  尾) 的尾部肌肉，以及        10 尾
              从而加快胶原蛋白的形成            [7-8] 。                   5  月龄野生型和     3  种  5  月龄突变体鱼 (各    10尾) 的
                   PCOLCE  在富含    I 型胶原蛋白的结缔组织和                尾部椎骨。所有样品采集后立即液氮速冻，并保
              纤维化组织中含量丰富，是胶原蛋白沉积的正调                            存于−80℃    备用。本研究获得华中农业大学实验
              节因子 ，其表达失调与多种疾病的发生发展相                            动物管理和使用伦理委员会批准 (批准文号：
                     [3]
                          [9]
              关。Xiang   等 发现     PCOLCE  在胃癌肿瘤组织中              HZAUFI-2023-0013)，实验过程中操作人员严格遵
              表达上调，被视为一种新的免疫浸润的预后生物                            守华中农业大学实验动物相关伦理规范，并按照
              标志物。Massoudi 等     [10]  表示  PCOLCE  的缺乏可能       华中农业大学伦理委员会制定的规章制度执行。
              会导致角膜修复缺陷。Wang 等               [2]  发现  TWIST1
                                                                1.2    PCOLCE  基因的生物信息学分析
              能够促进     PCOLCE  的表达，加快骨肉瘤细胞的侵
              袭和转移，从而减小骨肉瘤患者的生存概率。此                                从   NCBI  (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)  或
              外，研究表明       pcolce 基因在发育中的骨骼中表达                 Ensemble (http://asia.ensembl.org) 获取了  7  种鱼类：
              水平较高 ，pcolce 基因的表达对骨骼的发育具有                       半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis)、青鳉 (Oryzias
                       [3]
              重要的作用。在小鼠 (Mus musculus) 中，pcolce 基              latipes)、斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)、斑马鱼、
              因表达下调会导致成熟的             I 型胶原蛋白含量下降，             草鱼 (Ctenopharyngodon idella)、团头鲂 (Megalo-
                                           [4]
              pcolce －/－ 雄性小鼠股骨骨质降低 。由于真骨鱼类                    brama amblycephala)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus)
              基因组复制事件，斑马鱼 (Danio rerio) 包含           pcolce    和热带爪蟾 (Xenopus tropicalis)、小鼠 (Mus muscu-
              基因的    2  个亚型，pcolcea  和  pcolceb。在斑马鱼中，         lus)、人 (Homo sapiens) 的  pcolce 基因序列。使用
              通 过   MO (morpholine)   注 射 引 起 的 斑 马 鱼  pcol-   DNAMAN   对物种的同源序列进行比对，并通过

              ceb  基因的表达降低，会导致斑马鱼胚胎背部化发                        PhyloSuitev1.2.3  的  MAFFT  算法进行相似性比对后
              育异常 。尽管有研究显示              pcolce 基因在脊椎动          构建进化树，在       itol 网站 (https://itol.embl.de/) 进行
                     [11]
              物骨骼发育中发挥一定作用，但                pcolce 基因在斑        可视化。同时，利用在线网站 (http://gsds.gao-lab.
              马鱼中调控骨骼发育的分子机制尚不清楚。                              org/index.php) 揭 示 物 种 之 间 基 因 结 构 相 似 性 ，
                   前期实验室已发表的          60 dpf (受精后   60 d) 斑    并使用    AlphaFold3 (https://alphafoldserver.com/) 预
              马鱼尾部肌肉 (含肌间刺) 单细胞转录组数据发现，                        测斑马鱼     pcolcea  和  pcolceb  基因的蛋白质三级
              pcolcea 基因在肌腱细胞、成骨细胞中均有表达，                       结构。
                                                [12]
              而  pcolceb  基因在成骨细胞中特异表达 ，以上结
                                                                1.3    原位杂交
              果表明    pcolcea  与  pcolceb  基因可能在骨骼发育中
              存在功能分化。因此，本研究在利用                 CRISPR/Cas9         全胚胎原位杂交以          24、48、72 hpf (受精后
              基因编辑技术构建          pcolcea  和  pcolceb  基因敲除斑     72 h) 的野生型斑马鱼胚胎为研究对象，观察                 pcol-
              马鱼品系的基础上，通过突变体表型观察和功能                            cea  和  pcolceb  基因在斑马鱼胚胎发育时期的表达
              基因表达分析，探讨           pcolcea  和  pcolceb  基因对鱼    位 置 。 pcolcea  的 原 位 杂 交 探 针 引 物       F:  5'-
              类骨骼发育的调控作用。                                      CATCTCCACGTCCAACACCA-3'和        R:  5'-TAATA
                                                               CGACTCACTATAGGGCTGTTCCGGTGCCTC
               1    材料与方法
                                                               TGC-3'。 pcolceb  的 原 位 杂 交 探 针 为  F:  5'-GGG-
                                                               GCATCTGGGACACATAA-3'和        R:  5'-TAATACG
               1.1    实验材料
                                                               ACTCACTATAGGG  CCACAGAAGCGACCCAGT
                   实验中所使用的野生型           AB  品系斑马鱼亲本            TT-3'。全胚胎原位杂交根据           Thisse C  和  Thisse B

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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