Page 27 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 王文秀，等：pcolcea 和 pcolceb 基因在斑马鱼骨骼发育中的功能分化 50 卷

所描述的方法进行 [13] 。使用 Sigma-Aldrich 的抗 国) 标记细胞核。采用 ZEISS LSM 800 激光共聚
DIG-AP，Fab 片段 (Roche, SKU: 11093274910) 作 焦显微镜 (ZEISS，德国) 采集图片。
为抗体。采用 SZX-16 型奥康体视显微镜 (奥康 1.4 斑马鱼突变品系构建
SZX-16，日本) 采集图片。
在 Ensembl 数 据 库 (https://asia.ensembl.org/
切片荧光原位杂交以 60 dpf 野生型斑马鱼为
Danio_rerio/Info/Index) 下 载 斑 马 鱼 pcolcea 和
研 究 对 象 ， 取 其 尾 部 组 织 。 处 理 后 使 用 Leica
pcolceb 基 因 的 DNA 序 列 ， 在 crisprscan 网 站
UV1900 冷冻切片机 (Leica，德国) 沿肌肉横断面
(https://www.crisprscan.org) 上筛选合适的基因敲除
切片，切片厚度 10 μm。切片荧光原位杂交交采
靶点，通过 oligoevaluator 网站 (http://www.oligoe-
用 Wang 等 [14] 的方法进行，探针序列从 Beliveau valuator.com/LoginServlet) 检测敲除位点的特异性
等 [15] 设计的斑马鱼探针序列库中提取 (https://oli- 及脱靶效率。使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术
gopaints.hms.harvard.edu/genome-files)， 交 由 生 工 靶向斑马鱼的 pcolcea 和 pcolceb 基因。gRNAs 和
生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表 1)。使用 PCR 的测序引物列在表 2 中。通过对 2 种单基因
488 荧光探针标记 pcolcea 基因，cy3 荧光探针标 敲除纯合突变体进行杂交，并对其后代进行基因
记 poclceb 基因，DAPI 染料 (Thermo Fisher，美 型分析，获得了 pcolcea 和 pcolceb 基因的双基因

表 1 pcolcea 和 pcolceb 基因荧光原位杂交探针合成引物序列
Tab. 1 Primer sequence synthesis of fluorescent in situ hybridization probes for pcolcea and pcolceb genes
引物名称 序列 (5′—3′)
primer name primer sequence (5′—3′)
pcolcea-probe1 ACATTA GAGACCACGCGGGATGCTGG A ACCATGCTGGATCTAG AAGATA
CCACCTGCAGACGGAGAAT TAATGTTATCTT
pcolcea-probe2 ACATTA GGAGATGAGAGCCCCAGGCC A ACCATGCTGGATCTAG AAGATA
ACCATCATGGTGTTGGACG TAATGTTATCTT
pcolcea-probe3 ACATTA CACCACATTGCCCTCTGGGA G ACCATGCTGGATCTAG AAGATA
AAAATCCTGAAGGACAGCA TAATGTTATCTT
pcolcea-probe4 ACATTA TCATGAGTTTGACAGACATGGT A ACCATGCTGGATCTAG AAGATA
AATGGGCATTTCTTGCAGGG TAATGTTATCTT
pcolceb-probe1 ACATTA CTGATGCCTGCTGGGTAATC T TACTAGCTCGATTCAA AAGATA
CTGATATGTGCCAGGAGCA TAATGTTATCTT
pcolceb-probe2 ACATTA TGTGAGTGTGGCAGATGTGC A TACTAGCTCGATTCAA AAGATA
GGACATTTACTGCATGTGG TAATGTTATCTT
pcolceb-probe3 ACATTA GTCGGTCACCAGATGTCCAC G TACTAGCTCGATTCAA AAGATA
TCACTGGCCACAAATCCTG TAATGTTATCTT
pcolceb-probe4 ACATTA AGGGGTTCAAAATGCCAAGA G TACTAGCTCGATTCAA AAGATA
ATGCTGTAGGGCGAAGCTG TAATGTTATCTT

表 2 斑马鱼 pcolcea 和 pcolceb 基因的 gRNAs 靶序列及基因突变检测引物序列
Tab. 2 gRNAs target sequences of pcolcea and pcolceb genes and primer sequences of genotype in D. rerio
引物名称 序列 (5′—3′) 目的
primer primer sequence (5′—3′) purpose
pcolcea-target taatacgactcactataGGGGATCTGGTTGGAGACTCgttttagagctagaa 基因敲除
pcolceb-target taatacgactcactataGGAGGTGGAGATCAGGGCTCgttttagagctagaa
pcolcea-check F: TCTCAAGCCACCATAAATGCAATG 靶点检测
R: ACGATGGGAATCCTTCACTTCC
pcolceb-check F: TGGACACTCATACACAGTGCAG 靶点检测
R: AGCGTGAAGTCAGCTTACCA
pcolceb-seq F: CTCTCCTGCTCTCTAGGCCC 测序
R: TGGATTGATATTAAAGGCAAAGCGT

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