Page 77 - 《水产学报》2025年第11期

杨磊，等 水产学报, 2025, 49(11): 119607

用于石蜡切片和组织观察，每个平行各取 2 尾 KEGG 等数据库的注释，获得各数据库的注释
备用。另一部分肝脏和鳃组织样本被置于冻存 信息，并对其注释情况进行统计。RNA-Seq 数
管中置于液氮，随后存放于−80℃ 超低温冰箱 据可以在 NCBI 的 SRA 数据库中查看，登录号
中用于基因表达分析。每个平行各取 2 尾。 为 PRJNA1068942。
石蜡切片样品及样品制作 首先从 70% 差异表达基因和通路富集分析 本研究
乙醇中分别取出 0、3、6 和 9 h 等时间点的肝 利用 Cuffdiff 软件中的 FPKM(每千个碱基的转
脏和鳃组织，每个时间点的样品各 2 个重复。 录每百万映射读取的片段) 方法对基因表达量进
参考杨合霖 [25] 的方法，将组织整齐切成小块， 行计算，采用 DESeq2 软件 [28] 进行差异表达分

进行脱水、透明和包埋。具体步骤：70% 乙醇→ 析 。 差 异 表 达 基 因 (DEG) 参 数 设 置 为 |log 2
80% 乙醇→90% 乙醇→95% 乙醇→100% 乙醇 (FoldChange) | ≥ 1 & P adj. ≤ 0.05。利用诺禾云
I→100% 乙醇 II→乙醇：二甲苯 (1∶1)→二甲苯 平台 (https://magic.novogene.com) 对差异表达基
I→二甲苯 II→二甲苯∶石蜡 (1∶1) →石蜡 I→ 因进行 GO 功能注释和 KEGG 通路富集分析。
石蜡 II→石蜡包埋机 (Arcadia) 包埋。包埋后使 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR) 为了进
用手动轮转切片机 (Leica RM2235) 切片，厚度 一步验证转录组数据，选取 10 个 DEGs 进行
为 6 μm，在载玻片上滴满蒸馏水，并将切片展 RT-qPCR 验证分析。利用 Primer Premier 5.0 软
开。然后进行脱蜡、染色。具体步骤：二甲苯→ 件设计特异性引物，送交生工生物工程 (上海)
二甲苯∶乙醇 (1∶1) →100% 乙醇→95% 乙醇→ 股份有限公司合成 (表 1)。RT-qPCR 实验采用
90% 乙醇→80% 乙醇→70% 乙醇→蒸馏水→苏 TaKaRa 相对荧光定量试剂盒，以 β-actin 为内
木精-伊红 (H.E 染色) 染色→流水→蒸馏水→伊 参基因，每个样品 3 次重复，验证所用样品为
前期实验经过相同处理的平行样品。利用 2 −∆∆C t
红染液→流水→蒸馏水→80% 乙醇→90% 乙醇→

100% 乙 醇 I→100% 乙 醇 II→乙 醇∶ 二 甲 苯 表 1 用于 RT-qPCR 验证的引物序列
(1∶1) →二甲苯 I→二甲苯 II。最后，用中性树 Tab. 1 Primer sequences for RT-qPCR validation
胶进行封片，并使用光学显微镜对切片进行检 基因ID 基因 引物序列 (5′-3′)
gene ID gene primer sequence
验。将制作合格的切片标本利用正置显微镜
EVM0009033 hsp70 F: TACCTCGGCCAAAAGGTGTC
(Nikon ECLIPSE Ni-E) 进行图像的采集和分析。
R: ATCAGGACGTTTCGTTCCCC
RNA 的提取及转录组测序 按照常规
EVM0003527 idha F: CTGACAAAGACTACAGCGTGACA
的 TRIzol 法提取对照组和碱胁迫处理 9 h 后的
R: GTCAGGATGTCCACTGGGTTA
金钱鱼肝脏和鳃组织总 RNA。通过 1% 琼脂糖 EVM0018943 upp1 F: GAACCGACCGCTATGCTATGT
凝胶电泳检测 RNA 质量及浓度，确保总 RNA 浓 R: GCTCAAGCCCTATTCCACCC
度大于 150 ng/μL，OD 260 nm /OD 280 n m 在 1.8~2.2， EVM0002747 gpx1 F: GAGCGATACGCCAGCAAA
以确保 RNA 未受降解或污染。随后委托北京诺 R: CCCGTTCACGTCCACCTT
禾 致 源 科 技 股 份 有 限 公 司 ， 利 用 illumina EVM0017793 cyp2k1 F: CCTTTCACCAACGCTGTCATC
NovaSeq 6000 (illumina，美国) 进行高通量测序。 R: AGGCTTCTCCCATTCGCTCT
转录组组装及注释 测得的数据通过 EVM0013159 slc25a36a F: AGCAGGTTTTACCGCCATCA
CASAVA 碱基识别 (base callling) 分析转化为原 R: TGCAGACATACCCCGGTAGA
始测序数据 (raw date)，去除 fastq 格式原始读 EVM0016600 ceacam5 F: TGGTCACCTCGTGTCCCTG
数 (raw reads) 中的低质量读数，并使用默认参 R: CAGGGTTCCTCGCCTTACAT
数 Trintey 软件 [26] 组装过滤的读数以获得干净读 EVM0009069 cd74 F: ACTCGGAGCGAATGGGTAGA
数 (clean reads)。使用 HISAT2 软件将配对末端 R: AATCATAGGCGTCTTGCTTGTC
clean reads 映射到参考基因组 (基因组登录号： EVM0014800 atnb233 F: GGGTGGAAGAAGTTTGTGTGG
[27]
GWHAOSK00000000.1)。利用 StringTie 软件对 R: GCCAGGTGGGCTTGTAGTCA
质控后的 clean reads 进行新转录本组装，并对 EVM0004241 samhd1 F: CTCCACAGAAGAGCCTACCAGC
R: TTCCCTCCAGAGCCTTCAATC
新 转 录 本 进 行 Pfam、 SUPERFAMILY、 GO、

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