Page 41 - 《水产学报》2025年第8期

梁政远，等 水产学报, 2025, 49(8): 089104

统计孵化率、畸形率、出膜后 24 h 和 48 h 存 1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应 (qRT-PCR)
活率。 测定基因表达
孵化率指孵出的仔鱼个体数占受精卵总数
以磷酸苷油酸脱氢酶 (gapdh) 为内参，用
的百分比，计算公式：孵化率 (%) = 出膜鱼苗
qRT-PCR 法测定孵化酶 c 基因 (hec)、谷胱甘肽
数/受精卵总数 ×100%。
S 转移酶基因 (gst)、唾液酸糖蛋白受体 1 基因
畸形率指脊柱或尾部弯曲的仔鱼个体数占 (asgr1)、超氧化物歧化酶基因 (sod)、脂肪酸结
孵出仔鱼总数的百分比，计算公式：畸形率 (%) = 合蛋白基因 (fabp)、elovl 脂肪酸延长酶 7 基因
出膜鱼苗畸形的尾数/出膜鱼苗的总尾数 ×100%。 (elovl7)、脂肪酸结合因子 1 基因 (fbf1)、重组信
24 h 和 48 h 存活率是指在出膜后第 24 小 号结合蛋白 j 基因 (rbpj)、低氧诱导因子 1α 基
时和第 48 小时存活的仔鱼数占孵化仔鱼总数的 因 (hif1α)、热应激蛋白 b1 基因 (hspb1) 和血管
比例，计算公式：存活率 (%)=(N /N )×100%， 内皮生长因子 a 基因 (vegfα) 等基因表达，各引
t
0
式中，N 为出膜后 t 小时存活的仔鱼尾数，N 0 物序列见表 1。引物通过 NCBI Primer BLAST
t
为孵出的仔鱼总尾数。 平台设计，由生工生物工程 (上海) 股份有限公

分子样品采集 根据观察的发育特征， 司 合 成 。 用 于 qRT-PCR 的 检 测 样 品 及 其 总
确定 18~20 ℃ 为最适孵化温度。采集 18 ℃ 孵 RNA 与 RNA-seq 测 序 所 用 样 品 一 致 。 利 用
化温度下多细胞期 (multicellular stage, MC)、囊 PrimeScript™ RT reagent Kit 反 转 录 试 剂 盒
胚期 (blastula stage, BT)、原肠期 (gastrula stage, [RR037A，宝生物工程 (大连) 有限公司，中
GT)、神经胚期 (neurula stage, NR)、器官形成早 国 ] 制备 cDNA，使用 SYBR Premix Ex Taq™
®
期 (organogenesis-early stage, OE)、器官形成后 II 试剂盒 [RR820A，宝生物工程 (大连) 有限公
期 (organogenesis-late stage, OL)、出膜期 (hatch- 司 ， 中 国 ] 在 CFX96 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪
ing-out stage, HO) 受精卵各 10 枚 (即每个时期 (BioRad，美国) 检测表达数据。反应程序：95 ℃
30 枚)，用液氮快速冷冻后，保存于−80 ℃，用 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (40 个循环)；95 ℃
于基因表达分析。 10 s。相对表达量通过 2 −ΔΔCt 法计算。

表 1 qRT-PCR 所用引物序列表
Tab. 1 The list of primer sequences used for qRT-PCR
基因 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′) 扩增效率/% 片段长度/bp
gene forward primer (5′-3′) reverse primer (5′-3′) efficiency length
hec AATCCACACTGTCACGCTCC AGCAACATGGACCTCAGAGC 95.1 127
gst CTGGTTCCCCACAAGGTACT CAAAGCCACCAGCCGTTACT 96.7 73
asgr1 TCGTCCGGTTGCCCATTATC CATGTCGATGGTTGCAGTGG 106.7 138
sod CGACATGCCTGACCTCATCT TGGAGACAACACAAACGGGT 101.2 95
fabp ACGGTCGGCTTGGTTACATT CATTGTCGTCCGTCCTGTGA 98.4 158
elovl7 AGCTGTATCCTGTCCCCCAT CACTGGGGCCTAGGTTGATG 103.6 141
fbf1 TCGTCTGCTCGACCTCTACA ACTCACCTGAGCGCAAATCA 104.2 126
rbpj GGAGGTGGATGTAGAAGGCG TTTAACAGGCTGCGGTCACA 102.9 106
hif1α GCATCCTGCTCCTTCCCTTT TCAACAAGTGTCTGGGGCTC 102.6 142
hspb1 GATCTCAACCACGCCGTCTT TCAAACAGACAGCGGACAGC 98.1 98
vegfα ATCCCATGTTGGCGCACTTA CCTAGGCACCGTGGATGTTT 101.5 105
gapdh AGTGGAAATCGTGGCGATCA GCCGTGGGTGGAATCATACT 98.4 82

1.5 统计分析 和方差分析。数据满足正态分布 (Shapiro-Wilk

采用 SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计 检验) 和方差齐性检验 (Levene’s 检验) 要求，进

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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