Page 71 - 《水产学报》2025年第5期

王金霓，等 水产学报, 2025, 49(5): 059607

Scientific, 美国) 中，保存于−80 °C。鉴定性别 软 件 SPSS 20.0 的 单 因 素 方 差 分 析 (“*”代 表
后，将 15 对相同性别的性腺进行混管，使用 P<0.05、“**”代表 P<0.01、“***”代表 P<0.001)，
TRIzol (Thermo Scientific, 美 国 ) 试 剂 提 取 总 数据均为平均值±标准差 (mean±SD)。

RNA 后，用反转录试剂盒 (Thermo Scientic，美 本研究获得了浙江万里学院实验动物管理
国 ) 合 成 cDNA， 利 用 AMPure XP Beads Kit 和使用伦理委员会批准 (20220708001)，实验过
(Beckman，美国) 进行 cDNA 片段纯化，随后 程中操作人员严格遵守浙江万里学院实验动物
使用北京诺和智源生物技术有限公司 Illumina 伦理委员会的伦理规范，并按照浙江万里学院
HiSeq2000 平 台 进 行 测 序 。 每 个 时 期 ， 雌 性 伦理委员会制定的规章制度执行。

ZW 和雄性 ZZ 各 3 个生物学重复。将原始数据
中低质量序列 (N 比率高于 5%、接头序列) 过 2 结果

滤后获得 Clean reads，使用 Cufflink 2.1.1 软件
2.1 中华鳖 14~20 期性腺形态差异
计算基因的 RPKM (reads per kilobase per million
mapped reads) 值。根据基因的 RPKM 值，利用 为了解析中华鳖胚胎期雌雄性腺的形态差
异，利用体式显微镜对 14~20 各时期的中肾性
R4.0.3 软件绘制基因表达热图。

腺复合物拍照。鉴定性别后分为 ZW 雌性和
1.7 RNA 提取和实时荧光定量 PCR 雄性性腺。分析发现 期胚胎雌、雄性
ZZ 14~17
收 集 14~20 各 时 期 的 性 腺 于 TRIzol 腺的形态一致 (图版Ⅰ-1~4，8~11)，18 期胚胎
(Thermo Scientific, 美国) 中，保存于−80 °C。按 后雌性性腺相对细长 (图版Ⅰ-5~7)，而雄性的
照 TRIzol 试剂盒 (Thermo Scientific，美国) 方法 性腺粗短 (图版Ⅰ-12~14)。

提取 RNA：收集 14~20 期的性腺于 TRIzol 中；
2.2 中华鳖 14~20 期性腺结构差异
氯仿抽提 2~3 min (TRIzol∶氯仿体积比 5∶1)，
离心 10 min；异丙醇沉淀 10 min (TRIzol∶异丙 对中华鳖 14~20 期的胚胎性腺进行 H.E 染
醇，体积比 2∶1)，离心 10 min；乙醇清洗；溶 色发现， 14~16 期 ZW 雌性性腺和 ZZ 雄性性
解。按照反转录试剂盒 (Thermo Scientific，美 腺可分为明显的皮质区与髓质区。17 期 ZZ 雄性
国) 步骤合成 cDNA：取 1 μg RNA；将 RNA、 性腺髓质区出现了明显的性索结构 (图版Ⅱ-11)，
Oligo dT、ddH O 2 按照一定体系混匀放入 PCR ZW 雌性性腺中没有性索 (图版Ⅱ-4)。18~20 期
仪中，程序为 65 °C (10 min)，结束后放置冰上 ZZ 雄性性腺中髓质区开始高度发育，性索结构
静置；将缓冲液、dNTP、反转录酶和 RNA 酶 越来越明显，可明显观察到生殖细胞分布在性
抑制剂按照一定体系混匀，放入 PCR 仪中，程 索内部 (图版Ⅱ-12~14)。18~20 期，ZW 雌性性
序为 42 °C (1 h)、70 °C (5 min)、16 °C (Forever)； 腺皮质区高度发育，皮质区的细胞层数变多，
将得到的 cDNA 放入−20 °C 保存。以 GAPDH 生殖细胞主要集中在皮质区 (图版Ⅱ-5~7)。

为内参(表 1)，使用比较阈值循环 (C ) 方法 [22] 计 2.3 中华鳖 14~20 期雌雄生殖细胞分布差异
t
算样品中的相对 mRNA 水平。

Ddx4 在生殖细胞中特异性表达，因此利
1.8 数据分析
用 DDX4 的抗体对 14~20 期胚胎性腺切片进行
每个实验数据 3 次生物学重复。数据利用 免疫荧光染色。在中华鳖 14~20 期雌性和雄性

表 1 qPCR 分析的基因及其引物序列
Tab. 1 Genes and primer sequence of qPCR
基因 上游序列 下游序列
gene forward primer reverse primer
Gapdh GGCTTTCCGTGTTCCAACTC GACAACCTGGTCCTCCGTGTATC
Ddx4 GTCGTGATATATGGAGGTACGCA TGACGCCTGTCTTTTGATGG
Dazl CTTACCATGTGCAACCCAGA TGTAGGTGGGCTGGTATCC
Stra8 GCTTATCTCAGGCACGACACC GCCTTACGCAAAACCTGACAC
Dmc1 CCTCAAACAGACCAGCGTTC CCCTAGTTCTTCTTGCACCAC

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