Page 70 - 《水产学报》2025年第5期
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王金霓，等                                                                 水产学报, 2025, 49(5): 059607

              分化的影响，斑马鱼            (Danio rerio) 在发育阶段         孵化箱的温度保持在            29.5~30.0 °C，湿度保持
              性腺中生殖细胞数量较多时发育为雌性，且消                             在  80%~85%。中华鳖的采集时期参照中华鳖胚
              除部分生殖细胞后发生性逆转的现象 ，雌性                             胎发育时期     [21]  进行。
                                                  [5]

              XX  青鳉   (Oryzias latipes) 和在消除生殖细胞后，            1.2    中华鳖性别鉴定
                                  [6]
              后代出现全雄的现象 ，但在小鼠                  (Mus muscu-
              lus) 和鸡  (Gallus domesticus) 中，将胚胎期的生                利 用   PCR  鉴 定 性 别 ， 中 华 鳖 胚 胎 提 取
                                                               DNA  后，利用性染色体的           DNA  片段进行扩增，
              殖细胞消除后，却未发生性别逆转 。研究表
                                                [7]
                                                               扩增产物进行        1%  琼脂糖凝胶电泳。用于性别
              明 ， Ddx4  (DEAD-Box  Helicase  4)、 Dnd  (dead
                                                               判定   PCR  的引物序列，上游引物：5'-GATCG
              end protein homolog) 和  Dazl (deleted in azoosper-
                                                               AATTACATCCTGCCT-3'，下游引物：5'-TAAA
              mia like) 等基因在脊椎动物生殖细胞的发生以
                                                               TTAGGAACTGGAAGACACC-3'。
              及维持方面起作用          [8-12] ，其中  Ddx4  是保守的母
              源性基因，在生殖细胞正常发育过程中必不可                             1.3    GMC  形态拍照
                 [13]
              少 ，Ddx4     在生殖细胞中特异性表达，因此常
                                                                   收集   14~20  各发育阶段的中肾性腺复合物
              被作为生殖细胞标记基因，广泛用于研究生殖
                                                               (gonad and mesonephros complex，GMC) 固定于
              细胞的发育和分化过程 。在爬行动物中关于
                                    [14]
                                                               4%  多聚甲醛中，甲醇换液后，将样品平铺在培
              该基因的研究主要出现在中华鳖                  (Pelodicus sin-
                                                               养皿中，置于体式显微镜           (Zeiss，德国) 下，拍照。

              ensis) 中，在   1  龄雌性中华鳖中，Ddx4          信号在
              初级卵母细胞和生长期卵母细胞中表达 ，在                             1.4    石蜡包埋切片和苏木素-伊红染色
                                                    [14]
              成熟的雄性性腺中，Ddx4            在精原细胞、初级精                   收集   14~20  各时期的    GMC  样品，4%     多聚
                                                  [15]
              母细胞以及成熟精子中有较强的表达 ，但关                             甲醛固定     24 h，甲醇换液后，于−20 °C           保存。
              于早期中华鳖胚胎中雌雄生殖细胞的增殖和分                             甲醇保存的      GMC   样品经过二甲苯透明，用包
              化研究尚未见报道。                                        埋盒进行石蜡包埋。在石蜡切片机上进行连续
                   中华鳖是我国的名特优水产养殖品种，存                          切片，厚度为       6 μm，经脱蜡复水后，采用苏木
              在两性异形，雄性中华鳖具有更高的经济价值。                            素-伊红   (H.E) 染色  (碧云天，中国)，随后封片，
              中华鳖存在微小性染色体                (Z/W)，属于     GSD      普通光学显微镜        (Nikon，日本) 观察并拍照。

              (genetic sex determination，基因型性别决定) 物            1.5    免疫荧光染色
                 [16]
              种 ，目前在龟鳖类中对性别决定分子机制的
              研究大多集中在体细胞上              [17-20] ，而对生殖细胞             14~20  各时期的    GMC  样品石蜡切片经过脱
              的发育和分化研究有限。本研究通过组织形态                             蜡、复水后，置于柠檬酸钠中，96 °C                水浴，抗
              学观察、蛋白免疫荧光染色以及雌雄生殖细胞                             原修复    20 min，冷却后用封闭液          (10%  驴血清，
              发育相关基因的表达差异分析，初步分析了中                             3%  牛血清白蛋白，0.3% Triton X-100) 孵育        1 h，
              华鳖胚胎期生殖细胞的表达差异。研究结果将                             加入一抗，兔抗       DDX4 (1∶250，体积比，Abcam，
              补充中华鳖早期雌雄性腺中生殖细胞的相关研                             英国)，鼠抗      β-Catenin (1∶500，Sigma，美国)，
              究，也为探究爬行动物中生殖细胞与性别分化                             4 °C  过夜；第    2  天用  PBST  清洗  3  次，每次    15
              机制提供了参考。                                         min，避光加入二抗，Alexa Fluor 594           驴抗兔

                                                               IgG  (1∶500， 体 积 比 ， Invitrogen， 美 国 )，
              1    材料与方法                                       Alexa Fluor 488  驴抗鼠  IgG (1∶500，体积比，
                                                               Invitrogen， 美 国 ) 和  DAPI (1∶500， 体 积 比 ，

              1.1    中华鳖胚胎孵化
                                                               Sigma，美国)，37 °C      孵育   2 h，后用    PBST  清
                   实验所需的中华鳖受精卵购自绍兴市大畈                          洗  3  次，每次   15 min，后使用    PBS∶甘油     (1∶3，
              水产专业合作社。为确保实验材料一致性，所                             体积比) 封片，最后在激光共聚焦显微镜                   (Zeiss，
              有批次的中华鳖受精卵的采集时间严格控制在                             德国) 下观察并拍照。

              中华鳖产卵后        12 h  内，采用全裸无接触式恒温
              恒湿孵化箱孵化。将采集的中华鳖受精卵放置                             1.6    转录组测序和差异基因表达分析
              于孵化盘的定位孔中，动物极裸露于空气中，                                 收集   14~20  各时期的性腺于       TRIzol (Thermo

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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