Page 177 - 《水产学报》2023年第1期
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姜鹏飞，等                                                                 水产学报, 2023, 47(1): 019113

              胞中的定位。总体说来，与该基因的重要性相比，                           疣 梭 子 蟹  (MPC_11265.1)； 斑 马 鱼   (Danio rerio，
              其在蟹类上的研究极为薄弱。                                    NP_944603.2)；小鼠  (Mus musculus， NP_001192011.
                   中华绒螯蟹      (Eriocheir sinensis) 俗称河蟹，是      1)； 人  (Homo  sapiens，  NP_001076428.1)。 使 用
              我国重要的经济蟹类，已成为很多地区水产养殖                            DNAMAN   进 行 多 序 列 比 对 和 同 源 比 较 ， 使 用
              业的支柱产业 。生长和病害是中华绒螯蟹产业                            MEGAX  构 建 亲 缘 关 系 树 ， 使 用      ML(Maximum
                           [17]
              中两个最受关注的主题，选育生长快、抗病力强                            Likelihood) 计算方法，设定     bootstrap  为  1 000。
              的中华绒螯蟹新品种是主要育种方向之一。本实
                                                                1.3    Scarb1  的时空表达分析
              验通过基因克隆、时空表达分析和                 RNA  干扰，分
                                                                   分别取蜕壳前期、后期和间期的实验蟹各
              析了中华绒螯蟹        Scarb1  的结构和功能，筛选该基
              因的   SNP  标记并通过与生长相关性状的关联分析，                     6  只，在无菌环境下解剖取肝胰腺、肠道、鳃、
                                                               心脏、血淋巴细胞、肌肉共             6  种组织提取总     RNA
              以期为中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供
              参考。                                              并合成   cDNA。应用在线网站        (https://www.genscript.
                                                               com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design- tool) 设
               1    材料与方法                                      计  qPCR  引物  (表  1)。qPCR  的反应体系为      20 μL，
                                                               包括  SYBR Green remix Ex Taq 10 μL，上下游引
               1.1    实验蟹的饲养与生长性状测定
                                                               物  (10  μmol/L) 各  0.4  μL， cDNA(1  μg/μL)1  μL，
                   实验用蟹为处于蜕壳间期的“江海                21”幼蟹，       ddH O  8.2  μL。 反 应 条 件 为 两 步 法 扩 增 程 序 ：
                                                                  2
              来自上海海洋大学水产动物种质试验站，规格为                            94 °C  变性  30 s，94 °C  变性  5 s，60 °C  延伸  30 s，
              (16.84±5.68) g/只，附肢健全，饲养在循环水恒温                   共  40  个循环；设置熔解曲线温度从             65 °C  每  5 s
              河蟹个体养殖系统内 (遵循本实验室动物管理规                           上升  0.5 °C，逐步提高到       95 °C。每个样本设置        3
              定)。实验周期为所有实验蟹完成一个蜕壳周期。                           个技术重复，并作空白对照。
              实验期间每天晚上          8:00  投喂饲料，第二天早上                   按照   2 −ΔΔC t  方法进行基因的相对表达量计算。
              8:00  捞取残饵与粪便。记录初始体重 (Sartorius-                 当比较不同蜕壳阶段基因的相对表达量时，以蜕
              AG BS124S  电子天平测量)、壳长和壳宽             (游标卡        壳前期的     C 值作为对照。具体计算方法：ΔΔC =
                                                                         t
                                                                                                         t
              尺测定)，蜕壳       7 d  后再记录体重、壳长、壳宽，                 [(C t  目 的 −C t  内 参 )] 蜕 壳 阶 段 −[(C t  目 的 −C t  内 参 蜕 壳 前 期  ]。
                                                                                                  )
              统计这些指标的蜕壳后增长率：                                   当计算同一个蜕壳阶段不同组织的基因相对表达
                   GR = (T 2 ¡ T 1 ) =T 1 £ 100                量时，则以鳃组织的          C 值作为对照。使用         Graph-
                                                                                   t
              式中，GR     为生长相关性状         (体重、壳长和壳宽)             pad prism 9.0.0  分析相对表达量的差异性。
              的蜕壳增长率        (%)；T 为生长相关性状的蜕壳前
                                  1
                                                                1.4    RNA  干扰实验
              测量值    (g/cm)；T 为生长相关性状的蜕壳后测量
                              2
                                                                   从 在 线 网 站    (http://rnaidesigner.thermofisher.
              值  (g/cm)。
                                                               com/rnaiexpress/) 设计用于合成中华绒螯蟹         Scarb1
               1.2    Scarb1  的克隆与同源性比较                        的  dsRNA  引物  (表  1)。根据本实验室前期的         RNA
                   从实验蟹的第三步足基部柔软膜处抽取血淋                         干扰成果和本研究的预实验结果，选取注射剂量
              巴液   200 μL，参照本实验室的方法进行            RNA  提取、      为  3 μg/g  作为  RNA  干扰剂量。随机挑选处于蜕壳
              cDNA  合成及    Scarb1  的克隆 [18] 。扩增所需的引物           间期的“江海      21”幼蟹分为     3  组，每组   8  只蟹。干
              如表   1  所示。扩增产物经克隆后送生工生物工程                       扰组  1  为每  2 d  注射  1  次  dsRNA，至  15 d  结束  (简
              (上海) 有限公司进行测序。最后通过对比已发表                          称  15 d  干扰组)，干扰组      2  也为每   2 d  注射一次
              的中华绒螯蟹基因组确定该基因的相关结构。                             dsRNA，至    30 d  结束  (简称  30 d  干扰组)，最后
                   从  NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下载其  1 组为对照组，每        2 d 注射同剂量的双蒸水，至
              他相关物种的       Scarb1  并翻译成氨基酸序列：斑节                30 d  结束。
              对虾   (Penaeus monodon， XP_037793733.1)；凡纳            实验结束时，对每组实验蟹进行肝胰腺和肠
              滨对虾    (Litopenaeus vannamei， XP_027208402.1)；   道取样。肝胰腺在拍照观察后，取适量组织用于
              日本对虾      (Penaeus japonicus， QIH_55563.1)；三     类胡萝卜素含量测定和组织学观察。取肠道中段

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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