Page 30 - 《渔业研究》2026年第3期

第 3 期 戴景辉等： 患病杂交鲟鲟疱疹病毒 3 型与海豚链球菌的共检出、病理特征及药敏分析 323

1.5 细菌学检查 与 AciHV 感染相关。为明确病原类型，对感染样
1.5.1 病原菌分离与形态观察 本进行 AciHV-1、AciHV-2 和 AciHV-3 的分子检测。
在无菌条件下，分别将 6 尾患病杂交鲟（S1~S6） 具体方法为：参照 1.5.2 节提取肝脏、脾脏及肾脏
的肝脏、肾脏、脾脏、大脑组织进行划线接种，接 组织总 DNA，采用特异性引物（表 1）分别针对
种于 BHI 琼脂平板，在 30 ℃ 培养 24 h。挑取形态 3 种病毒型别的靶基因进行 PCR 扩增。PCR 反应
和大小一致的优势单菌落，转接至 BHI 琼脂平板 体系（25 μL）包含：12.5 μL 2×Hieff PCR Master
再次划线培养，以获得纯培养菌株，即分离菌，随 Mix，正、反向引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，DNA 模
后观察其菌落形态及菌体形态特征。 板 2.0 μL，以及 ddH O 8.5 μL。PCR 循环程序为：
2
1.5.2 分离菌 16S rDNA 基因序列测定与系统发 95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 30 s，退火 30 s（温
育分析 度见表 1），72 ℃ 延伸 60 s，共 35~40 个循环；72 ℃
使用成都福际生物科技有限公司提供的细菌基 终延伸 10 min。扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检
因组 DNA 提取试剂盒，按照说明书操作提取分离 测，利用产物回收试剂盒对预期大小的特异性条带
菌株的基因组 DNA，同时以 Weisburg 等 [18] 的方 进行回收纯化。纯化产物送往成都擎科生物技术有
法进行 16S rDNA PCR 扩增。PCR 反应体系：2× 限公司，连接至 pMD19-T 载体并转化至大肠杆菌
Premix Taq 25 μL，上、下游引物（浓度为 10 μmol/L） DH 5α 感受态细胞，经菌落 PCR 筛选验证后，随机
各 2 μL，DNA 模板 1 μL（20~100 ng） ，ddH O 2 补足 选取阳性克隆进行双向测序。所得序列经 BLAST
至 50 μL。PCR 扩增程序：94 ℃ 预变性 5.0 min；94 ℃ 比对分析，最终确认病原类型及其序列特征。
变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，35 1.8 临床样本病原检测
个循环；72 ℃ 温育 10.0 min。PCR 产物经 1.5% 琼 为明确患病杂交鲟主要的病原组成及其共检出
脂糖凝胶电泳检测后，由成都擎科生物技术有限公 特征，对 1.5.1 选取的临床样本（S1~S6）进行病
司进行双向测序。所得序列在美国国家生物技术信 原学检测与分析。其中，细菌检测按照 1.5 节所述
息中心（National Center for Biotechnology Informa- 方法进行菌株的分离培养及分子鉴定；病毒检测则
tion，NCBI）数据库中进行基于局部比对算法的搜 依据 1.7 节方法，对 AciHV-1、AciHV-2 及 AciHV-3
索工具（Basic local alignment search tool，BLAST） 进行特异性检测。各病原检测结果以“+”表示阳
比对分析，以初步鉴定菌株的种属信息。为进一步 性， “−”表示阴性。在此基础上，分别统计 AciHV-3
明确各菌株间的系统发育关系，使用 MEGA-XI 和海豚链球菌病原的检出率，并分析样本间多病原
软件对测得序列及其近缘参考序列进行多序列 共检出情况，以评估其共感染特征。
比对（Multiple sequence alignment） ，采用邻接法 2 结果与分析
（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，自举
（Bootstrap）分析重复采样次数设为 1 000 次，以 2.1 患病杂交鲟的临床症状与剖检
评估系统发育关系的可靠性。 患病杂交鲟体表病理变化如图 1 所示。患病杂
1.6 药敏试验 交鲟表现为明显的食欲减退，部分个体完全拒食，

对不同塘口患病杂交鲟的分离菌（TW2025-66~ 并伴随机体逐渐消瘦。体表常见体色明显加深。部分
TW2025-69），采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B） 个体在游动过程中出现运动协调障碍，难以维持正
进行体外药物敏感性试验，按照美国临床和实验室 常体姿，常伴随失衡或异常游动（图 1A） 。该病害
标准协会《M100 抗微生物药敏试验性能标准》 （第 呈现明显的急性发作特征，发病后迅速波及全塘，并
31 版） [19] 指导操作，将结果分为敏感（S） 、中 在数日内导致杂交鲟群体大规模死亡。在外观病变
敏感（I）和耐药（R） 。测试抗生素包括氟苯尼考、 方面，患病杂交鲟多见眼球凹陷（图 1B） ，体表及
强力霉素、恩诺沙星、环丙沙星、硫酸新霉素、复 下颌、口周围、胸鳍和腹鳍基部常见点状至斑块状
方新诺明、阿莫西林以及头孢噻肟。 出血（图 1C、图 1E） ，同时部分个体可见皮肤溃
1.7 AciHV 的 PCR 检测、克隆及测序 疡或局部组织异常增生（图 1D） 。上述表现提示
根据临床观察，本研究所采集的患病杂交鲟表 该病具有急性暴发、高致死率和显著的体表病理改
现出鳃丝贫血、体表组织出血、溃疡或增生等典型 变等特征。
病理特征。结合已有文献报道 [5-6, 16] ，以上症状疑似 病理解剖进一步显示，患病杂交鲟存在多器官