Page 92 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 付胜利等： 陵水才女虫自然感染程度对香港牡蛎凋亡及免疫相关基因表达的影响 633

的 PCR 样品进行测序。 中国）并按照试剂说明书抽提 RNA；NanoDrop
1.2.3 才女虫感染程度统计 2000（NanoDrop，美国）测定 RNA 浓度和纯度；
将清晰拍摄的含黑壳牡蛎照片导入 PS，然后 1% 琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的质量。使用反
选用快速选择工具或魔棒工具初步选中整个牡蛎贝 转录试剂盒（Vazyme）并按照试剂盒说明书反转
壳，通过 “窗口—直方图” 记录贝壳选区的像素总 录 DNA，将 1 μg 总 RNA 反转录为 cDNA，−80 ℃
数，设为 A；依据黑壳与正常贝壳的色差，调整魔 保存待用。将反转录后的样品以牡蛎 β-actin 和
[3]
棒工具容差，仔细选中黑壳部分，并用套索工具完 gapdh 为内参基因 ，按照 SYBR Premix Ex Taq TM
善选区，确保仅涵盖黑壳区域，再通过 “窗口—直 试剂盒（Vazyme）说明书，在 ABI 7 500 real-time
方图” 记录黑壳选区的像素数，设为 B。运用公式 PCR 仪上进行 qRT-PCR，以测定其相关基因的表
“黑壳面积占比= B/A×100%”计算，可得出黑壳面 达，设置 qRT-PCR 程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；
积在整个贝壳面积中的占比。参考 Laura 等 [21] 的 60 ℃ 1 min，40 个循环。采用 2 −ΔΔCt 计算各基因相
标准，将感染等级分为Ⅰ级：零星管道存在，黑壳 对表达量。引物在广州天一辉远生物科技有限公司
可见，无 U 型管；Ⅱ级：少于 2 个 U 型管道，并 合成，引物序列及相关信息见表 1。
少于 10% 的壳表面被侵染；Ⅲ级：超过 2 个 U 型 1.4 数据统计与分析
管 道 或 10%~25% 的 表 面 被 侵 染 ； Ⅳ级 ： 超 过 所有试验数据均以平均值±标准差（Mean±SD）

25% 的表面被侵染。 表示。数据采用 Graph Pad Prism 5.0 数据绘图，以
1.3 RNA 提取及 qRT-PCR One-way ANOVA 及 Tukey 法（Tukey honestly sig-
针对才女虫感染等级为Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级的牡 nificant difference 检验）进行单因素方差分析及显
蛎，从每个等级中随机选取 3 个样品，抽提其外套 著性检验，若 0.01<P<0.05，表示差异显著（*） ；
膜和肝胰腺的 RNA。使用 Trizol 试剂（Vazyme， 若 P<0.01，表示差异极显著（**） 。

表 1 实验所用引物序列
Tab. 1 The primer sequences used in this study
引物名称 序列（5’—3’ ） 引物名称 序列（5’—3’ ）
Primers Sequences (5’—3’) Primers Sequences (5’—3’)
X1-FF2 CCTWGTDATACCTRTCWTAATT HK-P53-F AAGAGTCAACGCCAACCACC
X1-R6 CCTGTAAATARAGGGAATCA HK-P53-R CCAGACACATGAACTGAAAGAGG
X1-F2 CCWGATATRGCATTCCC HK-Bax-F GTGACCAAGTAAACCCAAGTGC
X1-R2 GCKARYCADCTAAATACTTTAA HK-Bax-R CTGTTAATCCTAGGCCGACGA
HK-Casp3-F CGGCAGTGAGGATGAGGTTG HK-SABL-F TTACTTTTAATCTCCCTGCTTTGTT
HK-Casp3-R GATACTTCCGTCAGTCGTGGC HK-SABL-R AATACTCGTTTTCCATTTTTGACC
HK-Casp2-F GCTGTAGCTTACGTTTTTGCC HK-galectin-F CTTGACGGAGGGAGCAGAGT
HK-Casp2-R TTTGCTGTCTTTCGCCCTT HK-galectin-R GGTTAGCATTACGGACGACCAC
HK-Casp8-F TCACGGCAACAGTCTCCAAC HK-lysozyme-F TGGAACAAGTTTTAAGGCGTG
HK-Casp8-R GCATTCCGGCATACCTCAAC HK-lysozyme-R CCCAGTATCTGAGAGTGGATGG
HK-Casp7-F GAGATGGTCAGAATAGCAAGAAGTC HK-C3-F TACAACTATCGAAACACCACACTACC
HK-Casp7-R TGATTGGATCATTGGGTAAATAAAA HK-C3-R TTGCGGACCCAATCACCTAC
HK-FasL-F TGCAAATAAAGCAAAGTGGGAA HK-gapdh-F GGATTGGCGTGGTGGTAGAG
HK-FasL-R TTGGTTAGATTGATCGAGGAAGTC HK-gapdh-R GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC
HK-IAP-F GAAAAACCTAAGCACCCAAAGTAT HK-β-actin-F CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
HK-IAP-R TCCACCACCACAGAAAAAGC HK-β-actin-R TGGGCACCTGAATCGCTCGTT

2 结果 的起始体节及结构、触手形态、色素类型等形态特

征，结合课题组关于陵水才女虫（Polydora linshu-
2.1 才女虫种类鉴定及感染程度统计 iensis）的流行病学调查结果 [18] ，初步鉴定本次感
根据才女虫的粗足刺刚毛形态、鳃与巾钩刚毛 染牡蛎的才女虫为陵水才女虫。随机挑取 10 条才