Page 60 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 薛谦玺等：大黄鱼源贪食迈阿密虫（Miamiensis avidus）的分离鉴定、体外培养及药物敏感性研究 601

10 mg/kg 三个浓度梯度，每个处理设置 3 个平行重 端约 15 μm。表面纤毛排列整齐，体前部可见一伸
复，并设对照组。取纯净、高活性的盾纤毛虫，经 缩泡，体中前部有一圆形大核（图 1a） 。经甲基
低速离心（500 g，5 min）收集虫体，弃去原培养 绿−派洛宁染色后，可清晰观察到大核呈饱满椭圆
基，用新鲜配置的 SDM-79 培养基（盐度 30，pH 形，被染为深蓝色（图 1b） 。经姬姆萨染色后，
7.4）重悬，调整虫体密度至 1.0×10 个/mL，在 20 °C 可清晰观察到大核呈现紫红色，位于虫体中前部，
5
的条件下培养。台盼蓝染色计数存活率，根据死亡 呈椭圆形（图 1c） 。
率分级：敏感（>90%） 、中度敏感（≈50%） 、耐 2.2 分子鉴定结果与进化分析
药（<10%） 。 18S rRNA 作为保守性标记基因，有助于明确
1.7 统计分析 病原在盾纤毛目中的系统学位置；而 cox1 基因因
所有实验均设置 3 个平行重复，结果以均 其进化速率较快，可用于揭示近缘种间的分化关
值±标准差表示。采用 GraphPad Prism 10.1.2 软件 系。二者结合能够显著提高物种鉴定的准确性。针
进行单因素方差分析（One-way ANOVA） ，检验 对纯化的虫体样品进行分子鉴定，首先扩增了病
不同处理组间差异，显著性水平设定为 P < 0.05。 原 18S rRNA 基因部分序列。PCR 电泳结果显示，
实验数据及图表由 GraphPad Prism 10.1.2 绘制。 病鱼 DNA 样品中可获得大小约 1 800 bp 的清晰特
异性条带，与目标片段的理论长度基本一致。经测
2 结果与分析
序后，得到的有效序列长度为 1 706 bp。为进一步
2.1 盾纤毛虫的形态学观察 验证病原分子特征并辅助系统发育分析，再对线粒
倒置显微镜下活体观察显示，盾纤毛虫依靠体 体 cox1 基因进行扩增。PCR 产物电泳结果显示，
表纤毛螺旋式摆动推进游动，虫体呈瓜子形，前端 病鱼 DNA 样品成功扩增出大小约 700 bp 的条带，
略尖，后端圆钝，长约 25 μm，前端约 5 μm，后 测序后获得长度为 649 bp 的有效序列。

×1 000 ×1 000 ×1 000

A
D
C

B
10 μm a) 10 μm b) 10 μm c)

图 1 盾纤毛虫形态观察
Fig. 1 Scuticociliate morphology observation

注：a. 盾纤毛虫活体形态观察；b. 盾纤毛虫甲基绿-派洛宁染色观察；c. 盾纤毛虫姬姆萨染色观察（A. 大核；B. 伸缩泡；
C. 大核；D. 大核） 。
Notes: a. Live morphological observation of scuticociliate; b. Methyl green-pyronin staining observation of scuticociliate;
c. Giemsa staining observation of scuticociliate (A. macronucleus; B. contractile vacuole; C. macronucleus; D. macronucleus).

将本研究获得的虫株 ND202504 的 18S rDNA 构建的系统发育树（图 2a）显示，虫株 ND202504
与 cox1 序列提交至 NCBI 数据库，并采用 BLAST 与参考株贪食迈阿密虫 AY642280.1 聚为单一分
程序进行一致性分析。结果显示，ND202504 的 支，并与尾丝虫科（Uronematidae）的相关种群在
18S rDNA 部分序列与贪食迈阿密虫（Miamiensis 树的基部分离，明确隶属于嗜污科（Philasteridae） ，
avidus AY642280.1）序列的相似性高达 99.82%， 形成嗜污亚目（Philasterida）的独立分支。该分支
而其 cox1 部分序列与贪食迈阿密虫 MN688231.1 具有较高的自展值（bootstrap 支持度） ，进一步支
的相似性也达到 99.84%。这一结果表明，本研究 持了 ND202504 与贪食迈阿密虫的系统学亲缘关
所分离的病原与贪食迈阿密虫具有极高的分子一致 系。此外，基于线粒体 cox1 部分序列构建的系统
性，提示二者可能为同一物种或极为近缘的遗传 发育树（图 2b）呈现出与 18S rDNA 一致的分支模式，
型。在系统发育分析中，基于 18S rDNA 部分序列 ND202504 与贪食迈阿密虫 MN688231.1 紧密聚类，