Page 59 - 《渔业研究》2025年第5期
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600                                  渔  业  研  究                                     第 47 卷

              位；进一步在体外条件下探讨温度、盐度等关键环                           利用  TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒提取     DNA。
              境因子对其生长和生存的影响，并筛选具有良好抑                           选择  18S rRNA  和线粒体    cox1  基因作为扩增靶标，
              杀作用的候选药物。研究结果不仅将丰富对大黄鱼                           引物序列参照文献          [19, 25] 。PCR  反应体系  50 μL，
              盾纤毛虫病原的认知，也为该类病害的精准防控提                           包括：2× Hiff  Ultra-Rapid Ⅱ HotStart PCR Master
                                                                           ®
              供理论基础与技术支撑。                                      Mix 25 μL、模板 DNA 1 μL、上下游引物各 2 μL、
                                                               灭 菌 水  20  μL。 扩 增 条 件 ： 95  °C  预 变 性  30  s；
               1 材料与方法
                                                               35  个循环（95 °C 10 s，55 °C 10 s，72 °C 20 s） ；
               1.1 样品采集                                        最终延伸     72 °C 1 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电
                  病鱼样品于      2025  年  4  月采集自宁德海区某暴            泳验证后，送至北京擎科生物公司测序。所得序列
              发锥体虫病的大黄鱼养殖渔排。病鱼表现为在网边                           使用 BLAST   与  NCBI 数据库进行比对，并导入
              缓慢游动，体表溃烂，鳃丝发白，肝脏充血，部分                           MEGA 11  软件，采用      ClustalW  进行多序列比对，
              个体腹腔积液，肠道内充满大量黄色黏液。显微镜                           邻接法构建系统发育树，Bootstrap           设定   1 000  次，
              检查显示，其血液中存在锥体虫，同时在血液和体                           确定虫株的分类地位。
              表溃疡处检测到疑似大量活动的盾纤毛虫。共采集                            1.5 环境因子对盾纤毛虫的影响
              具有典型病症的大黄鱼           10  尾，个体体质量为       150~         盐度耐受性：为评估盾纤毛虫对不同盐度条件
              200 g。样品用充氧海水低温运输至实验室，立即
                                                               的适应能力，将纯培养的盾纤毛虫接种在盐度分别
              开展盾纤毛虫分离。
                                                               为  0、5、10、20   和  30  的人工海水中，初始接种密
               1.2 盾纤毛虫分离与体外培养
                                                               度 为  1.0×10   个 /mL。 培 养 体 系 统 一 设 置  pH  为
                                                                         5
                  为获得纯净且高活性的虫株，本研究参照赵庚                         7.4，温度为    20 ℃，每个盐度梯度设           3  个平行重
              彤等   [23]  的方法，从病鱼体表溃疡处分离盾纤毛
                                                               复，按预设时间取样进行台盼蓝染色计数。取                  100 μL
              虫。采用     SDM-79  培养基进行体外培养，并评估其
                                                               虫液与   100 μL 0.4%  台盼蓝染液充分混匀，染色          90 s
              生长与存活情况。SDM-79         培养基按    Brun & Schönen-
                                                               后，取   10 μL  加入血球计数板中观察。无色透明虫
              berger （1979） [24]  配方配制，经 0.22 μm  滤膜过滤
                                                               体为活虫，染成均匀蓝色者判为死亡虫体，不规则
              灭菌后使用，并补充热灭活胎牛血清（10%） 、血
                                                               着色为杂质，不计入统计。每组计数                  4  格，重复
              红素（7.5 mg/L） 、青霉素−链霉素−两性霉素抗生
                                                               3  次，取平均值用于后续分析，以评估其在不同盐
              素混合液。培养条件设定为盐度                 30、pH 7.4、温
                                                               度条件下的生长情况。
              度  20 °C；接种初始密度为        1×10  个/mL，设   3  个平
                                          4
                                                                   pH 耐受性：为探究盾纤毛虫对酸碱环境的耐
              行组，定期通过倒置显微镜（Eclipse Ti-S，Nikon）
                                                               受范围，在盐度为        30、温度为 20 °C 的条件下，在
              观察并计数虫体。
                                                               配制  SDM-79  培养基阶段通过加入           NaOH  或  HCl
               1.3 盾纤毛虫形态观察
                                                               调节   pH  为 5.5、6.5、7.4、8.5  和  9.0。每组设置
                  活体观察：取        10 μL  活虫液滴加于载玻片中
                                                                                                   5
              央，盖上盖玻片并轻压使其均匀铺展，在倒置显微                           3  个平行重复，初始密度同样设为 1.0×10  个/mL，
                                                               按预设时间取样进行台盼蓝染色计数，比较不同
              镜下由×100    至×400  逐级观察，记录虫体形态、运
              动特征及表面纤毛结构。                                      pH 条件下虫体生长状况及活性变化。
                  甲基绿−派洛宁染色：取            10 μL  虫液自然干燥             温度耐受性:为分析温度对盾纤毛虫生长的
              后，加入     4%  固定液，再加甲基绿−派洛宁染液染                    影响，在盐度为        30、pH  为  7.4  的条件下，将其分
              色  2 min，流水冲洗，盖玻片封片，在×400 下拍照                    别置于   0、10、20、25、26、28      和  30 °C 的恒温环
              记录。                                              境中培养。每个温度设置           3  个平行重复，初始密度
                                                                       5
                  姬姆萨染色：取        10 μL  活虫液滴加于洁净载玻             为  1.0×10 个/mL，按预设时间取样进行台盼蓝染
              片中央，待干燥后，滴加              10 μL 4%  的组织固定         色计数，以评估不同温度对其生长适应性的影响。
              液，待干燥后，滴加稀释后的姬姆萨染液，染色                             1.6 药敏实验
              8 min，流水洗去染液，并盖上盖玻片，在倒置显                             本实验共评价了大黄鱼源盾纤毛虫对 8 种不
              微镜下观察并拍照记录虫体形态。                                  同药物（香芹酚、盐酸联氨、阿苯达唑、大黄酚、
               1.4 盾纤毛虫序列比对和系统进化分析                             大黄素甲醚、非昔硝唑、吡喹酮、三氯异氰尿酸）
                  收集纯培养虫体，经梯度离心去除上清液后，                         的 敏 感 性 。 采 用 稀 释 梯 度 法 设 定      1  000、 100、
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