Page 6 - 《渔业研究》2025年第3期
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第 3 期                    王沈同等： 黄河三角洲飞雁滩牡蛎礁自然现状评估                                       263

              拼接具有     50%  至  75%  重叠的连续照片，并从正射               利用  TIANamp  海洋动物     DNA  提取试剂盒（Tian-
              影像中手动勾勒出         3  个斑块状牡蛎礁区，以确定礁                gen，北京，中国）提取牡蛎组织               DNA（n=30） ，
              区面积，礁区边界定义为贝壳基质覆盖率高于或等                           使用  1.5%  琼脂糖凝胶电泳和         NanoDrop2000  紫外
              于  25% [17] ，使用带标记的永久基准进行比例尺设                    分光光度计（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，
              定，并通过      ImageJ 软件（版本     1.53 K）测量礁区          马萨诸塞州，美国）分别评估               DNA  的质量和浓
              面积。此外，使用全球定位系统测定每个斑块礁区                           度。通过     Wang  等 [19]  建立的多重聚合酶链式反应
              中心位置的纬度和经度，并利用               Google Earth  定位    （PCR）方法鉴定牡蛎物种。PCR              反应体系包括
              牡蛎礁的坐标位置。                                        以下成分：20 ng      模板   DNA、2.5 μL10×缓冲液、

              1.3 牡蛎丰度与生物量                                     25 μL  水、1 U Taq  聚合酶（Promega，WI，USA） 、
                  在  2022  年  7  月至  9  月低潮期，对已绘制的牡蛎           2.0 mmol/L MgCl 、150 μmol/L dNTP、0.6 μmol/L
                                                                              2
              礁群划分为多个网格隔断，每个网格分配编号，以                           通用引物、0.4 μmol/L COⅠ物种特异性引物和
              便随机选择      6  个网格作为    0.25 m × 0.25 m 样方牡蛎      0.6 μmol/L  通用引物（表    1） 。COⅠ片段的扩增条
              采样点。在每个样方内，计数所有活体牡蛎，以计                           件：初始变性        95 °C，2 min；51 °C  退火   1 min，
              算其丰度和生物量。牡蛎的丰度和生物量分别以每                           72 °C  延伸  1 min，共  30  个循环；72 °C  延伸  5 min。
              平方米的个体数量和湿重表示。此外，用数显游标                           所有多重    PCR  产物在   1.5%  琼脂糖凝胶中分离后，
              卡尺测量     50  个牡蛎的高度、长度和宽度，精确到                    使用   TIANgel 中型纯化试剂盒（Tiangen，北京，
              0.01 mm，并称量其总湿重，精确到             0.01 kg。         中国）进行纯化，最终多重             PCR  产物通过    Sanger

              1.4 牡蛎群体结构与个体状况评估                                测序法进行测序（Tsingke，北京，中国） 。
                  本研究应用牡蛎大小频率分布与条件指数评估                             利用  Kimura2  参数（K2P）模型和基于个体的
              群体结构与个体状况，牡蛎的大小频率分布通过测                           邻接（Neighbor-joining，NJ）系统发育树（1 000        次
              量  6  个样方中采集的样品壳高确定，使用                Shapiro-   自举）在    MEGA X   软件（版本      11.0.13）中对样本
              Wilk  检验方法评估壳高的正态性，统计分析在                   R     的  COⅠ序列与巨蛎属物种的遗传距离和系统发育
              语言（版本      4.1.1）中进行，当      P<0.05  时表明具有        关系进行分析。所有已知牡蛎物种的                 COⅠ序列均
              统计显著性，每个牡蛎的条件指数根据以下公式计                           从  GenBank  中下载，包括近江牡蛎（Crassostrea
              算 [18] ：条件指数=组织干重/（总湿重−贝壳湿重） 。                   ariakensis：AY632564） 、福建牡蛎（C. angulata：

              1.5 物种鉴定                                         AF152567） 、长牡蛎（C. gigas：AF152565） 、香
                  通过线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（Cytochrome                     港牡蛎（C. hongkongensis：AY632556）和熊本牡
              oxidase Ⅰ，COⅠ）区域的基因序列确定牡蛎物种，                     蛎（C. sikamea：AF152568） 。


                                       表 1    多重  PCR  检测中使用的通用引物和物种特异性引物
                              Tab. 1    The universal and species-specific primers used in multiplex PCR assays
                                    引物 Primers                                引物序列 Primer sequences
                              正向通用引物 Forward universal                  GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
                              反向通用引物 Reverse universal                  TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
                       Car183r             近江牡蛎 C. ariakensis           AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCGG
                       Can222r             福建牡蛎 C. angulata             AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAGG
                       Cgi269r             长牡蛎 C. gigas                 TCGAGGAAATTGCATGTCTGCTACAA
                       Chk387r             香港牡蛎 C. hongkongensis        GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG
                       Csi546r             熊本牡蛎 C. sikamea              AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAACC


              1.6 沉积物相对粒径测定                                    的沉积物样品，对        30 g  沉积物加入    30~60 mL 30%
                  分别从牡蛎礁的       4  个站位（38.112°N、118.732°E；     过氧化氢溶液进行预处理，以去除有机物，处理
              38.114°N、118.734°E；38.116°N、118.736°E；38.118°N、  时间为   24~96 h，随后使用马尔文激光粒度仪              Mas-
              118.738°E）和相邻非礁区的         4  个站位（38.108°N、       tersizer 3000（Malvern Panalytical 公司，伦敦，英
              118.728°E；38.106°N、118.726°E；38.104°N、118.724°E；  国）进行粒径分析。沉积物的粒径依据温特沃斯粒
              38.102°N、118.722°E）采集无壳且粒径小于            2 mm     径分类法进行测定        [20] ，包括粗砂（500~2 000 μm） 、
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