Page 141 - 《水产学报》2026年第04期

4 期 毛梦琦，等：基于环境 DNA 的浙江中北部海域三疣梭子蟹时空分布 50 卷

层水样采集于海面以下 0.1~1.0 m；中层水样采集 梭子蟹的特异性引物和探针，并由生工生物工程 (上
于表层与底层之间的中部位置；底层水样采集于 海) 股份有限公司合成。
靠近海底但避免扰动沉积物的水层，在河口及近 采用酚/氯仿抽提法提取三疣梭子蟹及其近缘
岸海域采样点一般控制在距海底约 2 m处。上述 种的基因组 DNA，以所获基因组 DNA 为模板，
水层划分用于分析不同水层 eDNA 浓度的垂向分 通过实时荧光定量 PCR(qPCR)，对初步设计的引
布特征。 物及 TaqMan 探针进行特异性验证。
为防止样品采集与过滤过程中发生交叉污染， 1.4 质粒标准品的构建
过滤漏斗先用自来水清洗后，在 10% 的次氯酸钠
使用验证成功的引物，以提取的三疣梭子蟹
溶液中浸泡 10 min，再次用自来水充分冲洗；每
基因组 DNA 为模板，进行 PCR 扩增。扩增反应
[19]
个样品过滤前再用娃哈哈纯净水冲洗 1 次 。同
为 25 μL 的体系：12.5 μL Mix (已含缓冲液)，9.5 μL
时，以无菌蒸馏水作为过滤阴性对照，用于监测
ddH O，1 μL 模版 DNA，上下游引物各 1 μL。扩
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采样与过滤环节的潜在污染。每个样品过滤时均
增条件：95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性 30 s，55 ℃
更换一次性手套，以避免交叉污染。使用孔径为
退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环，72 ℃ 终
0.45 μm的玻璃纤维素滤膜 (海宁市德滤新材料科
延伸 5 min。扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳后，
技有限公司) 进行过滤，将每个样品用铝箔纸包裹
通过 TA 克隆将目的片段插入质粒中，经蓝白斑
后存放于 2 mL 冻存管内，速冻于−196 ℃ 的液氮
筛选后测序鉴定，完成质粒标准品构建后，测定
中 ，带回实验室后转移至−80 ℃ 冰箱保存，直
[20]
其浓度并计算拷贝数。将质粒 DNA 按 10 倍浓度
至提取 eDNA。上述操作可有效降低样品采集与
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梯度稀释（10 ~10 拷贝/μL），作为 qPCR 标准品，
过滤过程中发生外源 DNA 污染及假阳性的风险。
构建标准曲线并计算扩增效率。
本次调查同步使用单船底拖网渔船“浙普渔
43019”(船长 30 m，主机功率 184 kW) 开展作业。 1.5 实时荧光定量 PCR
按照《海洋渔业资源调查规范》(SC/T 9403-2012) 从浙江中北部水样中提取 eDNA 作为模板，
[21]
要求 ，使用网口拉紧周长 50 m、网身拉直长度 以构建的质粒标准品绘制标准曲线，采用三疣梭
48 m 的底拖网，以约 3 kn 的航速在各站位持续拖 子蟹特异性引物及 TaqMan 探针在 7300 Plus 实时
网 1 h。 荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems）上进行
本研究未涉及实验动物操作。环境 DNA 样 检测。20 μL 反应体系含 10 μL PCR Mix、4.9 μL
本采集及其同步底拖网调查，均为常规渔业资源 ddH O、4 μL 模板 DNA、上/下游引物各 0.4 μL
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调查活动，符合我国现行野生动物保护法律、法 及 0.3 μL TaqMan 探针；阴性对照以 ddH O 2 替代
规及行业技术规范要求，未对目标物种及其栖息 模板 DNA。热循环参数：50 ℃ 2 min（UNG 酶消
环境造成明显干扰。 化）；95 ℃ 2 min（酶激活）；94 ℃ 3 s、60 ℃
30 s，40 个循环 [24] 。每轮扩增均设阴性对照，结
1.2 环境 DNA 提取
果均未检出扩增信号，表明无外源 DNA 污染。
使用 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen，Hilden，
1.6 数据分析
德 国 ) 从 保 存 的 滤 膜 中 进 行 环 境 DNA 提 取 [22] ，
DNA 提取后用 100 μL 的 AE 缓冲液洗脱，再使 利用 ArcGIS 10.4.1 软件对 29 个采样站点的
用 OneStep PCR Inhibitor Removal 试剂盒 (ZYMO 三疣梭子蟹 eDNA 浓度进行可视化分析。鉴于环
Research，美国) 去除抑制剂 [23] 。提取的 DNA 存 境 DNA 浓度数据通常呈现高度偏态分布且包含大
储于−80 ℃ 冰箱备用。 量零值，为降低极端值对分析结果的影响并增强
不同站位间的可比性，对 eDNA 浓度数据进行
1.3 三疣梭子蟹特异性引物和 TaqMan 探针的
ln(eDNA+1) 转换后用于空间分布展示与统计分析。
初步设计及验证
其中 eDNA 浓度取各站位不同水层中的最大值，
从 NCBI 下载三疣梭子蟹及其近缘种的线粒 以生成其水平分布图；结合 Ocean Data View 5.7.2
体基因组全序列，利用 Primer Express 3.0.1 软件 软件绘制垂直分布剖面图，综合展示浙江中北部
和 NCBI 在线引物设计工具，初步设计用于三疣 海域三疣梭子蟹 eDNA 的时空分布格局。基于 R

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