Page 129 - 《水产学报》2026年第04期

4 期 苏生法，等：基于环境 DNA 宏条形码解析长江口及其邻近海域鱼类群落结构的季节与年际动态 50 卷

TCGTAAGACTGCGT-3’) 和 MiFish-E (5’-CATAG- 予以记录和分析。
TGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’) 进 行 PCR 多样性分析 基于最终确定的物种-ASV
[18]
扩 增 。 反 应 体 系 (50 μL) 包 含 2×PrimeStar Max 丰度矩阵，计算每个样本的 Alpha 多样性指数，
DNA Polymerase (TaKaRa，日本) 25 μL，正反向 包括 Shannon-Wiener 指数 (H’)、Simpson 优势度
引物 (10 μmol/L) 各 2 μL，DNA 模板 3 μL，无菌 指数 (D) 和 Pielou 均匀度指数 (J’)，以评估群落内
水补足 50 μL。PCR 程序：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 20 s， 物 种 丰 富 度 、 优 势 度 与 分 布 均 匀 性 [24] 。 使 用
56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32 个循环； 72 ℃ 5 min。 Kruskal-Wallis 检验分析不同季节或年份间 Alpha
每个样本设置 3 个 PCR 重复，并设立无模板阴性 多样性指数的显著性差异。采用 Bray-Curtis 距离
对照。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测后， 算法计算样本间群落组成的相异性，并通过非度
由壹健生物科技 (苏州) 有限公司进行纯化、建库， 量多维尺度分析 (NMDS) 以可视化群落结构的
并在 Illumina NovaSeq 6000 平台进行 PE250 测序。 Beta 多样性差异，从而揭示不同季节或站位间鱼
[25]
1.3 生物信息学与数据分析 类群落结构的相似性与差异性 。利用 PERMAN-
OVA 分析 (Adonis 函数，置换 999 次) 检验季节与
数 据 处 理 原 始 测 序 数 据 在 QIIME 2
年份因素对群落结构的影响。所有统计分析及可
(v2024.10) 平台进行处理。使用 cutadapt 去除引物
视化均在 R 语言 (v4.3.1) 环境中完成，主要使用
序列。通过 DADA2 对序列进行质量过滤、去噪、
vegan、ggplot2 等程序包。
拼接和嵌合体过滤，获得高精度的扩增子序列变
体 (amplicon sequence variants，ASVs) 及其丰度表。 2 结果
物种注释与验证 物种注释通过将代表
性 ASV 序列与 MitoFish 数据库 (2023 年版) 进行 2.1 eDNA 宏条形码测序结果
BLASTN 比对完成。为确保注释准确性，设定严
经 Illumina NovaSeq 6000 平台测序，4 个航
格的判定标准：(1) 仅保留比对覆盖度为 100% 的
次 共 获 得 原 始 双 端 序 列 17 477 708 条 。 经 过
结果；(2) 序列相似度 (Identity)≥98% 时，方可注
DADA2 去噪、质量过滤及嵌合体去除后，共获得
释至物种水平；(3) 若一个 ASV 的最佳比对结果
高质量序列 16 690 083 条，平均每个样本高质量序
以相同最高分匹配多个物种，则将其注释至这些
列数为 219 606 条，测序质量值 (Q30) 均高于 85%。
物种共有最低分类层级 (通常为属级) [19-21] 。基于此，
2022 年春季获得原始序列 2 636 208条，其中高质
生成初步的物种注释列表。
量序列 2 511 847 条 (有效率 95.28%)；2022 年秋
为最大限度去除测序过程中的污染数据，本
季获得 8 044 621 条，其中高质量序列7 798 505 条
实验实施了两级质控策略：首先，进行阴性对照
(有效率 96.94%)；2024 年春季获得原始序列 2 928
污染过滤，剔除在任一阴性对照样本 (如提取空白
903 条 ， 其 中 高 质 量 序 列 2 776 196条 (有 效 率
对照、PCR 阴性对照) 中检出的 ASV，无论其丰
94.79%)；2024 年秋季获得原始序列3 868 378 条，
度高低，以消除实验过程中引入的污染；其次，
其中高质量序列 3 604 535 条 (有效率 93.18%)。经
实施低丰度过滤，结合绝对丰度与相对丰度双重
阴性对照污染过滤和低丰度过滤后，共剔除潜在
阈值，剔除在所有样本中总读数低于 10 的 ASV，
污染及低置信度 ASV 127 个，最终保留用于后续
同时剔除在单个样本中相对丰度低于该样本总读
分析的 ASV 总数为 384 个。
数 10% 的 ASV，从而降低测序错误和痕量污染
2.2 鱼类物种组成与历史记录对比
对结果的影响。
为评估 eDNA 监测结果的可靠性，将上述鉴 基于 4 个航次的 eDNA 测序结果，共鉴定出
定出的物种列表与东海鱼类区系的历史记录进行 鱼类 219 种，隶属于 2 纲 21 目 87 科 159 属。其
对比。参考书目主要为《中国海洋及河口鱼类系 中，硬骨鱼纲 (Actinopterygii) 包含 214 种，软骨
统检索》 [22] 与《中国海洋鱼类》 ，二者系统收 鱼纲 (Chondrichthyes) 包含 5 种。鲈形目 (Perci-
[23]
录了东海已知鱼类种类。计算 eDNA 检出物种中 formes) 为绝对优势类群，共计 102 种，占总物种
与历史记录相符的种类所占的比例 (符合率)。对 数的 46.58%；其次是鲽形目 (Pleuronectiformes，
于 eDNA 检出但未见于上述历史记录的种类，亦 18 种) 和鳗鲡目 (Anguilliformes，17 种) (图 2)。

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