Page 91 - 《水产学报》2025年第12期

李雪珽，等 水产学报, 2025, 49(12): 129308

1.4 样品鉴定与分析 1.5 数据分析
菌种分子鉴定 通过生工生物工程 (上 多样性指数是表示群落内种类多样性程度
海) 股份有限公司真菌基因组 DNA 快速抽提试 的指标，用于判断群落或生态系统的稳定性。
剂盒进行柳珊瑚共附生真菌基因组 DNA 提取。 Shannon-Wiener 指数 用于衡量群落中
PCR 扩 增 引 物 序 列 为 ITS1(5'-TCCGTAGGTG 物种多样性，Shannon 指数越大，表示真菌群落
AACCTGCGG-3') 和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTAT- 多样性越大，群落复杂程度越高。计算公式：
TGATATGC-3')。PCR 反应体系 (50 μL)：1 μL
S ∑
基因组 DNA (20 ng/μL)、5 μL 10× Buffer (含 2.5 H = − P i lnP i
2+
mmol/L Mg )、1 μL Taq 聚合酶 (5 U/μL)、1 μL k=i
dNTPs (10 mmol/L)、1.5 μL ITS1 引物 (10 μmol/L)、 Margalef 指数 用于衡量群落中物种的
1.5 μL ITS4 引物 (10 μmol/L)，加 ddH O 2 补至 50 丰富度，Margalef 指数越大，表示真菌群落丰
μL。PCR 扩增程序：预变性 95 ℃ 5 min；95 ℃ 富度越高，群落内物种越丰富。计算公式：
变性 30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min， D = (S −1)/log N
2
循环 35 次；终延伸 72 ℃ 7 min。
Pielou 指数 用于衡量群落中物种个体
通过天根生化科技 (北京) 有限公司酵母基
数目分配的均匀程度，Pielou 指数越大，表示
因组 DNA 提取试剂盒 (离心柱型) 进行柳珊瑚
群落中物种分布越均匀。计算公式：
共附生酵母菌基因组 DNA 提取。PCR 扩增引
物序列为 26SF(5'-GCATATCGGTAAGCGGAG- J = H/lnS
i
GAAAAG-3') 和 26SR(5'-GGTCCGTGTTTCAAG 式中，P 为第 i 种菌株数量占样品分离所得菌
ACGG-3')。PCR 反应体系 (50 μL)：1 μL 基因 株总数的比例；S 为物种总数；N 为个体总数。
组 DNA (20 ng/μL)、 5 μL 10× Buffer (含 2.5 1.6 功能预测
2+
mmol/L Mg )、1 μL Taq 聚合酶 (5 U/μL)、1 μL 基于 FUNGuild 数据库预测柳珊瑚共附生
dNTPs (10 mmol/L)、 1.5 μL 26SF 引 物 (10
真菌功能谱 (http://www.funguild.org/)，区分共
μmol/L)、 1.5 μL 26SR 引 物 (10 μmol/L)， 加
附生真菌营养方式与生态功能组，置信水平选
ddH O 2 补至 50 μL。PCR 扩增程序为：预变性 择可能与高度可能。
95 ℃ 5 min；95 ℃ 变性 30 s，58 ℃ 退火 30 s，
72 ℃ 延伸 1.5 min，循环 35 次；终延伸 72 ℃ 2 结果
7 min。
PCR 产物纯化、测序由上海派森诺生物科 2.1 柳珊瑚共附生真菌种类鉴定
技股份有限公司进行，利用 BLAST 程序将拼接
从柳珊瑚样品中分离、排重后获得 54 株
后的序列文件与 NCBI 数据库中的已知菌种序
共附生真菌，对 54 株共附生真菌进行 ITS 和
列进行比对，将序列相似度高于 97% 的物种信
息作为鉴定结果。本研究采用最大似然法 (ML) 26S rDNA 测序鉴定，所有送检菌种均测序成功。
构建系统发育树。以通用时间可逆模型 (Gen- 结果发现，柳珊瑚共附生真菌多样性丰富，包
eral Time Reversible model) 作为核苷酸替代模 含 青 霉 属 、 枝 孢 属 、 曲 霉 属 、 烟 管 菌 属
型，并采用离散 Gamma 分布 (+G，6 个类别) (Bjerkandera)、黑酵母属 (Hortaea)、短梗蠕孢
以拟合位点间的速率异质性，同时允许部分位 属 (Trichocladium)、接合孢菌属 (Zygosporium)、
点进化不变 (+I)，置信度来自 1 000 次非参数自 褐菌属 (Brunneomyces)、假丝酵母属、堪多脆
展抽样分析 (bootstrap)，建树于 MEGA X 软件 柄 菇 属 (Candolleomyces)、 金 孢 霉 属 (Chryso-
中完成。 sporium)、螺旋聚孢霉属 (Clonostachys)、小鬼
菌落形态描述 富集后的菌板于恒温培 伞属 (Coprinellus)、杯梗孢属 (Cyphellophora)、
养箱中 28℃ 倒置培养 7 d，记录菌落颜色、菌 囊 担 菌 属 (Cystobasidium)、 德 巴 利 酵 母 属
丝特征、外观和边缘等特征。 (Debaryomyces)、 毛 壳 菌 属 (Dichotomopilus)、

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