Page 135 - 《水产学报》2025年第12期

俞韩绣，等 水产学报, 2025, 49(12): 129611

所有指标的测定均按照南京建成生物工程研究 reagent Kit with gDNA Eraser) 说明书进行反转录，
所生产的试剂盒说明书操作。 得到 cDNA 并于−20 ℃ 保存。利用 NCBI 数据
库查找目的基因序列并设计特异性引物 (表 1)，
1.5 肝胰腺抗氧化及免疫相关基因表达量测定
引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。
使用 TRIzol 法提取肝胰腺组织的总 RNA， 以 β 肌动蛋白 (β-actin) 作为内参基因，采用实
通过琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，并用 时荧光定量 PCR 方法测定各组相关基因的表达

微量紫外分光光度计检测 RNA 的浓度和纯度。 量，每个样品进行 3 次重复，通过 2 −∆∆C t 方法进
按 照 TaKaRa 逆 转 录 试 剂 盒 (PrimeScript RT 行计算。
TM

表 1 荧光定量 PCR 扩增引物序列
Tab. 1 Real-time fluorescence quantitative PCR amplified primer sequence
引物名称 上游引物序列(5′-3′) 下游引物序列(5′-3′)
primer forward primer reverse primer
Prx TGTGGATGGCCAGTTCAAGG CTCGACACGGTCAGAGAAGG
Nrf2 ATCTTGTTGGTCCCTCGCTC AGTATGGCAGGGTTGGTTGG
p53 AGACGCCCATTCTGCATTGT GGCGTCCTGCTTTTCTCATC
MyD88 AGGTGCACCAGAGTCATTGT CTACGCTGAGAGCATGAGCA
LZM CGCGACACCGAACGCTAC CGAGTTGGAACCACGAGACC
HSP70 GGTGTGCAACCCCATCATTAC TCCTCGATGGTGGGTCCG
β-actin GCGACATTGACATCAGGAAGG GCACTTGCGGTGAACGATAC
注：Prx. 过氧化物还原酶，Nrf2. 核因子E2相关因子2，p53. 肿瘤抑制基因p53，MyD88. 髓样分化因子88，LZM. 溶菌酶，HSP70. 热休克蛋白70。
Notes: Prx. peroxiredoxin, Nrf2. nuclear factor erythroid 2-related factor 2, p53. tumor suppressor gene p53, MyD88. myeloid differentiation primary
response protein 88, LZM. lysozyme, HSP70. heat shock protein 70.

1.6 肠道细菌高通量测序 1.8 数据分析
将斑节对虾肠道样品送至北京百迈客生物 所 有 实 验 结 果 以 平 均 值 ±标 准 差 (mean±
科技有限公司进行 16S rRNA 高通量测序。首 SD) 表示，采用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差
先提取肠道菌群的总 DNA，并根据 16S rRNA 分析 (One-Way ANOVA)，用 Duncan 氏多重检
的保守区域 (V3~V4 区) 设计特异性引物，在引 验法进行多重比较分析组间差异显著性，P＜
物末端添加测序接头，随后进行 PCR 扩增并对 0.05 说明差异显著。
其产物进行纯化、定量和均一化，构建测序文
库。使用 Illumina NovaSeq 6000 进行测序，获 2 结果
取原始图像数据文件，将其通过碱基识别后分
析转化为原始测序序列 (Raw Reads)。经质量过 2.1 不同养殖密度下斑节对虾生长性能
滤和去噪处理，得到有效数据，最终使用百迈
在不同密度养殖 42 d 后，斑节对虾的 SR
客云平台 (www.biocloud.net) 进行数据分析。
随养殖密度增加显著下降，且各组差异显著
1.7 肠道组织学切片的制作与观察 (P<0.05)。WGR、SGR、CF 均表现出先升后降

将经 Bouin 氏液固定后的肠道组织取出， 的 趋 势 。 其 中 ， WGR 和 SGR 表 现 为 D375>
进行梯度酒精脱水处理，随后进行包埋和切片。 D450>D300>D525>D225>D600，且 D300、D375
脱蜡后，使用苏木精-伊红 (H.E) 染色法染色， 和 D450 显著高于其他组 (P<0.05)；CF 表现为
最后于光学显微镜下观察肠道黏膜的组织学形 D450>D375>D300=D525>D225>D600。 FCR 则
态并拍照保存。在每个组织切片上随机选取 6 是先降后升，表现为 D225>D600>D525>D450>
根平直、伸展良好的肠绒毛，使用 Image J 软件 D300>D375，且 D375 显著低于其他组 (P<0.05)
测量肠绒毛的高度和宽度，及肠道的肌层厚度。 (表 2)。

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